哺乳动物卵母细胞成熟过程中的分子调控是精细的多阶段有序调控过程,任何缺陷和异常都有可能导致卵母细胞成熟或受精卵发育的障碍。细胞骨架(微丝和微管)的组装及其动态变化,促使卵母细胞发生皮质重组与极化,并排出第一极体。卵母细胞的成熟是一种独特的不均等分裂的过程,在此过程中是微丝形成的微丝流推动着纺锤体的迁移,促使卵母细胞完成不均等分裂。因此微丝的组装及动态变化是卵母细胞不均等分裂的关键调控因素。微丝成核因子是调控微丝的成核,聚合以及组装的蛋白。研究发现,微丝成核因子主要包括三大类:第一类是Arp2/3复合物及其成核促进因子(nucleation-promoting factors,NPFs)。Arp2/3复合物被认为是直接成核微丝的最关键的调控因子,其在卵母细胞不均等分裂中的作用是依赖于NPFs。近些年来在一些模式动物的卵母细胞成熟过程中有一些相关研究,但其在大型哺乳动物卵母细胞成熟过程中的表达和功能仍无验证性研究。NPFs能够激活Arp2/3来成核微丝,并参与微丝介导的一系列细胞进程。其中WASH复合物是最新鉴定的微丝成核促进因子,并被发现在果蝇等种属的微丝介导的卵子发生中具有重要的作用。第二类是Formin家族蛋白。Formin家族蛋白包含一类重要的子类蛋白家族,称为透明的相关formins(diaphanous-related formins,DRFs)。DRFs近些年来被发现参与许多与微丝相关的细胞功能,例如细胞形态发生,胚胎分化,胞质分裂及细胞极性等,其中FMNL1被报道在有丝分裂中定位在微管组织中心(MTOC),对纺锤体的形成,胞质分裂等具有十分重要的作用。第三类是包含WH2区域的微丝成核因子。近些年来关于微丝成核因子在卵母细胞减数分裂成熟过程中调控机制的研究已渐渐成为热门,但微丝成核因子在哺乳动物卵母细胞减数分裂的分子调控机制及其作用的蛋白信号通路迄今仍不十分清楚。阐明微丝成核因子在哺乳动物卵母细胞减数分裂中的分子机制,对于揭示哺乳动物生殖规律和机理,提高家畜繁殖效率乃至治疗人类不孕不育疾病,均具有重要的研究价值。本试验以雌性ICR小鼠和猪为研究对象,采用体外培养、抑制剂处理、显微注射MO(morpholino)来阻断蛋白翻译、免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜观察及免疫蛋白印迹(western blot)等方法,研究微丝成核因子调控哺乳动物卵母细胞成熟及其作用的蛋白信号通路。首先用免疫荧光染色法标记WASH复合物、Arp2/3复合物和FMNL1在卵母细胞减数分裂各个时期的表达与定位,随后分别通过显微注射特异性morpholino、特异性抗体注射或通过特异性蛋白抑制剂的处理,来阻断蛋白翻译、破坏蛋白功能或抑制蛋白表达,借以研究这些蛋白对卵母细胞微丝和纺锤体组装、减数分裂纺锤体迁移与定位、皮质颗粒区域重组、染色体的排列和分离以及细胞周期的影响,以期了解这些微丝成核因子蛋白对哺乳动物卵母细胞减数分裂中的调控作用。此外,用蛋白免疫印迹技术,检测上游蛋白或目的蛋白功能破坏后对微丝、微管相关调控蛋白表达的影响,以期进一步揭示微丝成核因子蛋白调控卵母细胞减数分裂的可能的蛋白信号通路,为深入了解微丝成核因子蛋白在哺乳动物卵母细胞成熟过程中的分子调控机理奠定基础。本研究共分3个部分,主要研究结果如下:试验一、微丝成核因子促进因子WASH复合物通过调控Arp2/3复合物参与小鼠卵母细胞的成熟过程在受精之前,卵母细胞需经历不均等分裂的过程,而这个过程主要有微丝调控。最近,WASH复合物被鉴定为微丝成核的促进因子(actin nucleation promoting factor,NPF),并可以激活Arp2/3复合物。然而,关于WASH复合物的作用,特别是在卵母细胞极化和不均等分裂中的作用并不清楚。这里,我们研究了WASH复合物的2个重要的亚基蛋白WASH1和Strumpellin在小鼠卵母细胞减数分裂中的作用。通过显微注射WASH1 morpholino或Strumpellin抗体来敲低WASH1蛋白的表达或干扰Strumpellin蛋白的活性,导致卵母细胞第一极体排出率显著下降,并出现均等分裂的现象。通过免疫荧光染色发现,这主要由于纺锤体的迁移失败引起的。活细胞时间延迟显微镜观测发现,敲低WASH1的蛋白表达水平后,卵母细胞膜上及胞质中的微丝信号强度降低。此外,敲低WASH1的表达后Arp2/3复合物的表达量显著降低。因此,我们的结果表明,WASH复合物通过调控Arp2/3复合物来参与小鼠卵母细胞中微丝介导第一极体的排出和胞质分裂过程。试验二、微丝成核因子Arp2/3复合物在猪卵母细胞成熟过程中的表达与功能Arp2/3复合物是微丝成核的直接调控因子,并在细胞极性,细胞迁移,和细胞内吞等许多细胞进程中起着关键性的作用。在本试验中,我们研究了Arp2/3复合物在猪卵母细胞成熟过程中的作用。免疫荧光染色表明Arp2/3复合物主要定位在猪卵母细胞的皮质区域,并且与微丝共定位。用特异性抑制Arp2/3复合物的生物学活性的抑制剂CK666处理后,Arp2/3复合物在卵母细胞的皮质区的表达显著降低。同时猪卵母细胞的成熟率显著降低,主要表现为卵丘扩散和极体排出失败。而且,CK666处理后导致微丝帽不能正常形成,微丝在猪卵母细胞的皮质区和胞质中的荧光强度显著降低。总的来说,我们的结果表明Arp2/3复合物通过调控微丝的成核表达参与猪卵母细胞减数分裂成熟的过程。试验三、微丝成核因子FMNL1通过调控细胞骨架的动态变化参与小鼠卵母细胞的成熟过程FMNL1(Formin-like 1)是Formin家族的蛋白成员,该家族的蛋白是微丝成核因子。尽管FMNL1在有丝分裂细胞的中被发现对细胞粘附,胞质分裂,细胞极化和迁移具有必须的作用,它在哺乳动物卵母细胞减数分裂中的作用并不清楚。在我们的研究中,我们主要通过显微注射FMNL1的特异性morpholino(MO)和活细胞观察来研究FMNL1在小鼠卵母细胞减数分裂中的功能。免疫荧光染色表明生发泡破裂后,除了胞质中的分布,FMNL1主要定位在纺锤体的2极。敲低FMNL1的蛋白表达导致第一极体的排出率显著降低,大极体率显著升高。时间延迟显微镜和免疫荧光分析表明这可能由于微丝的表达降低导致。微丝帽的消失说明皮质区极性被破坏,这说明纺锤体的迁移和定位异常。同时,纺锤体的形成也受到破坏,这主要是由于磷酸化MAPK的表达量降低引起的。此外,FMNL1的敲低导致顺式高尔基体的标记蛋白GM130的定位受到破坏,表达量也显著降低。最后,我们发现小GTP酶RhoA可能作用于FMNL1的上游。总结起来,我们的结果说明了 FMNL1可能作用于RhoA-FMNL1-GM130/p-MAPK蛋白信号通路调控微丝和微管的动态变化,从而影响小鼠卵母细胞的第一极体的排出。