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背景:神经系统损伤造成神经元不可逆的死亡,由此导致的神经功能缺损一直是困扰神经科医生的难题。随着神经干细胞的发现及对其深入研究表明,虽然神经组织也具有再生和自我修复的能力,可通过神经干细胞移植来治疗中枢神经系统疾病及其损伤,但是,由于神经干细胞取材困难,来源受限,又受到法律和伦理的限制,且异体移植的免疫排斥反应大,移植后成活率较低,这些都限制了神经干细胞的进一步研究和临床应用。间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓中除了造血干、祖细胞外的另一种细胞成分,其来源广泛,具有干细胞持续增殖和多向分化的特性,可跨胚层分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等,表现了多向分化潜能,并且可一直保持到分化的最后阶段。另外MSCs是来自中胚层的早期细胞,免疫原性弱,移植时可不使用免疫抑制剂,植入部位没有观察到肿瘤的发生[1]。因MSCs来源广,取材容易,对机体损伤小,安全性好,利用患者本人的骨髓获取的MSCs完全是自身的遗传背景,可避免免疫排斥反应,并且无伦理学方面的困扰,故更易于临床应用。因此,在中枢神经系统的细胞治疗中,MSCs是很好的细胞来源。近年来研究发现,间质干细胞移植后对神经损伤组织重建及功能恢复有治疗作用,在临床上具有广阔的应用前景。目前国内外学者已通过多种诱导方法,成功使MSCs分化为神经细胞,但是关于调控MSCs膜电位,用生物物理学方法诱导MSCs向神经细胞分化成功的报道尚不多。
目的:探讨调控膜电位诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的可行性;探讨膜电位值变化与诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化间的关系。
方法:采用Friedenstein全骨髓改良培养法,从大鼠的骨髓中分离出MSCs进行体外扩增。用浓度为10nM去极化剂哇巴因和10uM超极化剂匹那地尔分别处理分离出的MSCs。同时用全细胞膜记录方法,分别记录空白对照组、去极化组及超极化组分化0,12,24,36h后膜电位数值。比较分化后膜电位值的变化与细胞分化间的关系。采用免疫细胞化学染色法计算细胞分化率和蛋白质免疫印记法(Western Blotting)鉴定诱导前后细胞神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。
结果:经Friedenstein全骨髓改良培养法后,可成功分离培养出MSCs。免疫细胞化学显示:随着时间的延长,对照组中的NSE、NF和GFAP阳性率升高。在12、24、36h各时间点,超极化组中NSE、NF阳性率与对照组比较,均显著升高(P＜0.05),GFAP未见染色;去极化组中GFAP阳性率与对照组比较,均显著升高(P＜0.05),NSE、NF未见染色。蛋白质免疫印记法(Western Blotting)示:对照组随着时间的延长,NSE、NF及GFAP的蛋白水平表达量增高。与对照组比较,超极化组:NSE、NF的蛋白水平明显升高(P＜0.05),GFAP的蛋白水平未见表达(P＜0.05);去极化组:NSE、NF的蛋白水平未见表达(P＜0.05),GFAP表达量升高明显(P＜0.05)。
结论:Wistar大鼠MSCs在体外可分化为少量的神经细胞,大量的胶质细胞。通过调控膜电位可调控其向神经细胞的分化,去极化抑制其向神经细胞分化,促进向胶质细胞分化。超极化促进其向神经细胞分化,阻止向胶质细胞的分化。