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细胞膜的重塑(membrane remodeling)对于细胞器的生成、囊泡转运、细胞运动和胞质分裂等生理功能至关重要。含有BAR结构域的蛋白质家族被认为是重塑细胞膜的一类重要分子。已知BAR蛋白重塑细胞膜的分子机制有两类:一类是通过简单的脚手架(scaffolding)机制,即BAR结构域通过二聚化形成香蕉形状的结构,之后通过静电作用与细胞膜相互作用,以自身的曲率诱导细胞膜变形;另一类叫做两性楔形物插入机制,N-BAR通过N端的疏水或两亲性螺旋结构插入细胞膜来诱导膜变形。然而,有很多蛋白,其BAR结构域需要相邻的PH结构域来共同诱导细胞膜变形,其中的分子机制尚不明晰。 我们以ACAP1(ArfGAP with coiled coil,ANK repeat and PH)的BAR-PH结构单元(ACAP1BAR-PH)为研究对象,在原核表达体系中成功表达并纯化了ACAP1BAR-PH蛋白。将该蛋白作用于脂质体,利用电镜技术观察到了ACAP1BAR-PH可以使脂质体发生变形,从而确定了ACAP1BAR-PH对细胞膜的重塑作用。 为了进一步研究ACAP1重塑细胞膜的具体分子机制,我们测定了ACAP1BAR-PH的晶体结构。ACAP1 BAR-PH整个结构呈现紧密堆积的香蕉形状的同源二聚体,与同源结构相比,最大的不同在于香蕉形状的二聚体形成的曲率不同,比F-BAR的曲率大,而比APPL1和N-BAR Amphiphysin的小。与细胞膜重塑相关的结构特征如下:ACAP1BAR-PH的凹面有多个正电荷氨基酸簇,可能参与细胞膜的结合,突变体实验证明PH结构域上的K274R286是参与结合的关键因素;PH结构域上的Loop1含有疏水氨基酸并且朝向凹面一侧,极有可能插入细胞膜,突变体实验证明该Loop1在重塑细胞膜过程起到了重要作用。 ACAP1BAR-PH在脂质体表面形成螺旋组装体的冷冻电镜研究显示:两类螺旋结构ClassⅠ和ClassⅡ有着不同的螺旋衍射对称性和不同的直径,但是它们在脂质体膜上表现出类似的排列方式,即只有一端的PH结构域直接参与细胞膜的结合。由ACAP1BAR-PH二聚体再二聚化的四聚体是ACAP1BAR-PH在细胞膜表面自组装的基本单位,进而通过层内头对拱相互作用以及层间的侧面作用组装成螺旋结构。BAR结构域并不能紧密地覆盖在膜上,它的作用是参与ACAP1BAR-PH在脂质体膜上的组装。分子动力学模拟则阐释了PH结构域插入细胞膜的动态过程,进一步印证了冷冻电镜和生物化学与细胞生物学的结果。 综上,本论文解析了ACAP1BAR-PH高分辨率的三维晶体结构、低温电镜的螺旋三维结构,结合脂质体变形及生化细胞体内实验,以及分子动力学模拟,从分子水平阐释了ACAP1对细胞膜重塑的分子机制:在BAR-PH这样的结构单元中,PH结构域起到了关键作用,其通过识别磷酸化的磷脂酰肌醇来与细胞膜相互作用,并将一个两亲性loop插入细胞膜引起膜曲率变化并诱导膜变形,而BAR结构域仅仅起到一个支架作用,通过彼此相互作用在细胞膜上聚集,促进细胞膜的最终变形。我们提出了一种新的细胞膜重塑机制,为其他类似蛋白的重塑作用提供了借鉴,并加深了人们对细胞膜重塑领域的认识。