论文部分内容阅读
纳米颗粒在理化性质发生巨变的同时,其生物学效应的性质和强度也可能发生质的变化,随着纳米科技的发展和纳米材料的广泛应用,人类接触纳米材料的机会也迅速增多,因此纳米材料的生物安全性问题正逐渐受到人们的关注。纳米材料具有大量的界面,具有很强的吸附能力,从而能对金属离子或有机物产生吸附作用。当纳米材料大量进入环境后,特殊的表面效应使得其极易与环境中的多种污染物结合。重金属镉是一种广泛存在的环境污染物。镉可引起DNA损伤,具有致癌、致畸、致突变作用,是已确定的人类致癌物。作为环境中的常见致癌物,重金属镉与纳米材料的相互作用,对机体可能导致的各种健康效应有何变化,至今尚无研究。系统了解纳米材料与环境常见污染物的联合作用所致健康效应,不仅可以深入了解纳米材料在环境中的变化规律,也为深入了解纳米材料的健康效应提供科学依据。本研究主要通过一系列的体外实验来探究纳米四氧化三铁与镉联合作用对人肝癌HepG2细胞株的生长抑制和DNA损伤诱导基因(Growth arrest and DNA damage-inducible gene,GADD)153表达的影响和DNA断裂损伤、染色体损伤及凋亡等情况的影响,系统研究纳米四氧化三铁与镉联合作用所致DNA损伤效应,为进一步深入了解环境中纳米金属氧化物的健康效应提供实验依据。第一部分本部分主要研究了不同浓度的纳米四氧化三铁(nano-Fe3O4)和氯化镉(CdCl2)联合作用在体外对人肝癌HepG2细胞株生长抑制和DNA损伤诱导基因GADD153启动子诱导和GADD153基因表达水平的影响。本研究利用含pGADD153启动子的重组人肝癌HepG2细胞检测GADD153启动子活性,用RT-PCR测定内源性GADD153基因mRNA水平。重组人肝癌HepG2细胞的主要过程如下:将GADD153启动子插入pGL3basic萤光素酶表达质粒的萤光素酶基因上游,得到含GADD153启动子的pGADD153-LUC质粒,再用该质粒转染人肝癌HepG2细胞,构建pGADD153-LUC质粒重组HepG2细胞检测体系。外来化合物引起DNA损伤时,将诱导重组HepG2细胞GADD153启动子的活性增加,启动子活性增加导致萤光素酶表达增加,因此萤光素酶的表达量可以反映该启动子序列的活性程度,从而间接反应外来化合物的DNA损伤效应。我们设计了4组浓度的nano-Fe3O4(0g/L、0.002g/L、0.01g/L、0.05g/L)×4组浓度的CdCl2(0μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L)共16组受试物进行实验。结果发现单独的nano-Fe3O4能增加萤光素酶的表达但无显著差异,CdCl2单独作用能引起萤光素酶的表达的显著增加(P<0.01),nano-Fe3O4和CdCl2联合作用能够增加萤光素酶的表达且有协同作用(P<0.05)。RT-PCR结果发现nano-Fe3O4在1μmol/l和5μmol/l的CdCl2存在的条件下,能诱导GADD153基因表达水平增高。结果提示:nano-Fe3O4能够和CdC l2协同作用增强GADD153启动子的表达,并增强CdCl2引起的GADD153基因表达。第二部分本部分主要研究了不同浓度的纳米四氧化三铁(nano-Fe3O4)和氯化镉(CdCl2)联合作用在体外对人肝癌HepG2细胞株DNA损伤、染色体损伤和凋亡的影响。以单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE)、细胞松弛素B阻断核质分裂微核法(cytokinesis-block micronucleus )和碘化丙啶(propidium iodide, PI)单染流式细胞术来分别检测其对细胞DNA断裂损伤、染色体损伤和细胞凋亡的影响。我们设计了3组浓度的nano-Fe3O4(0g/L、0.01g/L、0.05g/L)×3组浓度的CdCl2(0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L)共9组受试物进行实验。结果发现CdCl2能引起DNA断裂损伤、微核率的增加和细胞凋亡率的增加;nano-Fe3O4能引起DNA断裂损伤增加,但无显著意义,未引起微核率和细胞凋亡率的增加;nano-Fe3O4能加重CdCl2的对细胞DNA断裂损伤和染色体损伤,且二者联合作用对DNA断裂损伤的结果经统计分析认为有协同作用。结果提示:在nano-Fe3O4和CdCl2并存时,后者对导致DNA的损伤起到了主要作用,但前者能够通过协同作用或其它方式增强后者对DNA的损伤作用。