背景与目的：慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML,慢粒)应用分子靶向治疗当今已成为越来越重要的方法,伊马替尼作为一个靶向启动白血病的Bcr-Abl酪氨酸激酶的小分子抑制剂,已迅速成为慢性粒细胞白血病慢性期(chronic phase,CP-CML)患者的一线标准治疗药物。Interferon plus cytarabine and STI571(IRIS)的8年数据结果显示,无事件生存率(event-free survival,EFS)高达81%,总生存率(overall survival,OS)达85%。在取得较好治疗效果的同时,伊马替尼的耐药率近几年越来越受到关注。根据IRIS研究中累积最佳血液学和细胞遗传学缓解率以及2009年European Leukemia Net(ELN)疗效标准,有10%-25%的患者被认为对伊马替尼耐药,即3个月未达到血液学缓解(complete hematological response, CHR)或18个月未达到完全细胞遗传学缓解(complete cytogenetic response, CCR)。由于伊马替尼必须与Bcr-Abl激酶相结合,影响细胞内药物浓度的因素可能影响疗效,目前比较明确的是伊马替尼是P-糖蛋白(PgP)外排泵的作用底物,但多个研究结果对三磷酸腺苷结合盒蛋白B亚家族成员1(ABCB1)基因编码蛋白PgP过表达是否影响伊马替尼的耐药性仍存在着争议,蛋白表达水平与其功能也并非一定相关。有实验近期评估了多药耐药基因序列的多态性,并且发现了3种不同单核苷酸多态性会导致对伊马替尼的不同MMR率,这说明不同的序列可能导致药物外排泵的功效发生改变,进而改变药物的疗效。近年,摄取转运蛋白,特别是有机阳离子转运蛋白1(hOCT1)被作为伊马替尼耐药的潜在根源进行了研究,多个实验结果表明,该基因的表达水平和功能均可影响伊马替尼疗效。临床上患相同疾病的不同个体在使用同一种药物治疗时,效果有时会有较大差异,表现为耐药或出现严重不良反应。其中遗传因素是导致药物代谢反应个体和人群差异的决定性因素。遗传突变引起药物代谢和反应差异主要来自于编码药物代谢酶、受体和药物转运蛋白的基因的遗传多态性。分析基因多态性的试验方法主要有：聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(polymerase chain reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP)、单链构象多态性(single strand conformation polymorphism, SSCP)分析,序列特异性引物-聚合酶链反应(polymerase chain reaction-sequence specific primer, PCR-SSP)、Southern印迹杂交方法、变性高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography and, DHPLC)以及变性梯度凝胶电泳分析(polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)等。本研究选取应用伊马替尼治疗获得不同疗效CML患者,分析骨髓细胞hOCT1和ABCB1基因的：nRNA表达水平对伊马替尼疗效的影响。对ABCB1高表达患者,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)及序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)技术,分析其C1236T、C3435T、G2677T三个位点单核苷酸多态性对伊马替尼治疗CML疗效的影响。方法：1.hOCT1、ABCB1基因mRNA表达水平对IM治疗CML疗效的影响1.1.研究对象：2008年1月至2011年6月在我院诊断并服用IM治疗的CML患者90例,中位年龄40(11-77)岁,男性61例,女性29例。其中慢性期(CP)88例,加速期(AP)2例。诊断后至应用IM治疗前的中位病程2月(7天-5年),应用IM中位剂量400(300-800)mg／日,中位疗程30(1-117)月。按临床疗效标准[9]评估疗效,并依据结果进一步分析耐药组17例(18.9%,其中原发耐药12例继发耐药5例)、部分细胞遗传学缓解(PCyR)组11例(12.2%)、CCR组62例(68.9%)分别与hOCTl和ABCB1mRNA表达水平的关系。1.2.引物设计与合成：根据GeneBank的序列设计hOCT1、ABCB1基因及内参基因GAPDH引物及探针。1.3.提取白血病患者骨髓单个核细胞,提取总RNA,逆转录成cDNA,进行实时荧光定量PCR。通过熔解曲线确定PCR产物的特异性。取两管平均Ct值计算2-ΔCT值,作为各标本mRNA的相对表达量,ACT=(目的基因CT值-内参基因CT值)。比较CML患者耐药组、PCyR组和CCR组间hOCT1和ABCBl mRNA表达水平的关系,两基因表达水平与IM疗程的关系。以本实验检测表达水平中位数为界,将研究对象分为高表达组与低表达组,比较两组间获CCR时间及比例的差异。1.4.应用SPSS13.0统计软件分析数据,计量资料呈非正态分布,用中位数描述；两组计量资料间分布比较用Kruskal-Wallis H法检验;两变量间相关分析采用Spearman rank correlation analysis;生存分析用Kaplan-Meier曲线；检验水准α=0.05,双侧检验。2. ABCB1基因多态性与IM治疗CML疗效的关系2.1.研究对象：2008年1月至2011年6月在我院诊断并服用IM治疗的CML患者中经PCR检测ABCB1mRNA水平高表达者48例,中位年龄38(11-68)岁,男性32例,女性16例。其中慢性期(CP)46例,加速期(AP)2例。应用IM中位剂量400(300-800)mg／日,中位疗程27(1-105)月。按临床疗效分为未达CCR组18例(37.5%,其中原发耐药11例、继发耐药5例、部分细胞遗传学缓解(MCyR)2例)、完全细胞遗传学缓解(CCR)组19例(39.6%)、MMR组11例(22.9%)。2.2.对ABCB1高表达患者进行基因多态性分析：采用聚合酶链反应-限制性内切酶法(PCR-RFLP)分析ABCB1C1236T、C3435T多态性；因ABCB1G2677T位点无特异性限制性内切酶,采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)分析其多态性。对表现型反应产物进行纯化测序,结合琼脂糖电泳结果确定所扩增片断为所需目的基因片断。2.3.用专门软件(HWE)对检测人群基因型频率进行Hardy-weinberg遗传平衡检验。统计学处理：采用Pearson x2检验比较各基因型、等位基因频率在伊马替尼治疗不同疗效组间差异,采用SPSS13.0软件进行统计分析。结果：1.RNA、cDNA纯度和质量分析：所提取总RNA、cDNA经紫外分光光度计检测,比值在1.8-2.0之间。2.任选一cDNA以10倍倍比稀释,目的基因和内参基因的CT值差(ACT)几乎不随模板浓度变化而变化,目的基因和内参基因的扩增效率基本一致。扩增后进入熔解程序生成熔解曲线,熔解曲线显示锐利的单一峰,无其它特异峰,说明扩增产物均一,无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳显示两基因所扩增片段条带单一,无引物二聚体和非特异性扩增。同样的原理扩增ABCB1基因。3. hOCT1、ABCB1mRNA表达水平与疾病状态：耐药组、PCyR组和CCR组之间差异有统计学意义,分别为χ2=9.761,P=0.008；χ2=8.511,P=0.014。采用多重比较分析,CCR组hOCT1mRNA表达水平高于耐药组和PCyR组(P=0.047、0.019),耐药组ABCB1mRNA表达水平高于CCR和PCyR组(P=0.045、0.021)。4.疗程与hOCT1、ABCB1mRNA表达的关系：比较服用IM时间3-6、～12、-24、-48、>48月患者的hOCT1、ABCB1mRNA水平。不同疗程组间hOCT1、 ABCB1mRNA均无统计学差异,χ2=5.178,P=0.270,χ2=4.298,P=0.367。5. hOCT1、ABCB1mRMA水平与获CCR时间及其相互关系：hOCT1高表达组CCR时间明显提前于低表达组间,χ2=7.506,P=0.006；ABCB1氏表达组达CCR时间明显提前于高表达组,χ2=3.870,P=0.049,18月内达CCR患者比例hOCT1高表达组、ABCB1氏表达组均明显增高(97%Vs89%,97%Vs88%),且在治疗6个月时最为显著(76%Vs53%,74%Vs53%)。应用Spearman相关系数法比较分析,两基因rnRNA水平呈负相关性,r=-0.655,P<0.001。6、人群基因型频率Hardy-weinberg遗传平衡检验,实际数与理论数差异无统计学意义(P值均大于0.5)人群均符合Hardy-weinberg遗传平衡,适合进行群体遗传学研究。7、ABCB1C1236T、C3435T、G2677T基因型分布在ABCB1高表达患者未达CCR组、CCR和MMR组间均不存在统计学差异。但在未达CCR患者C1236T位点T等位基因频率高于C(χ2=4.00,P=0.046),C3435T、G2677T中和G等位基因频率均分别明显高于T(χ2=7.111,5.444,；P=0.008、0.02)。结论：1.所提取RNA的cDNA纯度高、质量好,可用于后续实验。2.所设计的各基因引物特异性好、与管家基因扩增效率一致。3.CCR组hOCT1mRNA的表达水平高于耐药组和PCyR组；耐药组ABCB1mRNA的表达水平高于CCR和PCyR组。耐药组伴有hOCT1氏表达和(或)ABCB1高表达,说明药物转运蛋白是IM治疗成功的重要因素之一。4.IM治疗疗程不影响两基因的表达水平,提示hOCTl和ABCB1mRNA水平在IM治疗期间的稳定性可靠,不受用药时间的影响。5、hOCTl和ABCB1表达水平影响到达CCR的时间。6、ABCB1C1236T位点存在T型等位基因患者较C型IM疗效差,ABCB1G2677T、C3435T位点存在G、C等位基因患者较T型治疗效果差。