哮喘是世界范围内严重威胁公众健康的一种重要疾病，目前约有1亿以上的患者。近年来虽然有关哮喘的病理学、分子免疫学和分子药理学的研究进展较快，世界各国对于哮喘病的基础与临床研究均有较大的突破，但流行病学的调查显示，有关成人哮喘和儿童哮喘的发病率和死亡率并没有降低，反而有逐年增加的趋势。鉴于哮喘炎症网络的复杂性，人们意识到针对单一的靶标并不能有效地治疗气管炎症，而直接针对主要功能节点和通路的干预又会引起较强的毒副作用。中医治疗咳喘有独特的理论基础，而引入中医的治疗理念，针对复方中药多靶点、多环节、多途径、多组分配伍的用药特点，更能体现祛邪与扶正，治标与治本，协同与拮抗的辩证施治的原则。东西方医学体系及药物研发体系的融合，可能是解决各自发展中面临的挑战和瓶颈问题的一条重要途径。　　 甘草作为应用历史最广的代表药材之一，具有中和之性，调和诸药之功。甘草的主要活性成分为甘草酸，而甘草酸在体内迅速被代谢为甘草次酸。本论文以甘草酸与β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor，β2AR)激动剂的协同作用的分子机理研究为切入点，首先采用TNF-α诱导的人支气管平滑肌细胞的炎症模型，利用基因芯片技术考察了甘草酸和麻黄碱等药物干预前后细胞内35800个基因的表达变化，发现甘草酸介导的基因表达的变化主要集中在信号转导、受体磷酸化调节、离子通道、细胞凋亡等方面，为系统全面的了解β2AR激动剂和甘草酸的协同作用机制提供了线索。　　 本文构建了稳定表达血球凝集素(hemagglutinin epitope，HA)表位标签的β2AR细胞系——β2AR-HA-HEK293细胞系，通过HA标签实现了对β2AR的定位追踪及含量变化分析。结果表明，0.1mM甘草酸和甘草次酸均可以有效的抑制0.1mMβ2AR激动剂沙丁胺醇引起的β2AR在胞浆内形成的颗粒聚集；同时，β2AR与Gαs的免疫共沉淀实验结果表明，甘草次酸可以有效的提高β2AR和Gαs的偶联效率，降低β2AR的磷酸化的程度，阻断β-arrestins以及笼型蛋白(clathrin)和β2AR的结合，抑制衣被小窝的形成，抑制β2AR的内化，最终稳定了细胞膜表面β2AR的数量，保护了受体的功能。该结果为甘草酸或甘草次酸治疗或缓解β2AR激动剂引起的受体脱敏提供了理论依据。　　 采用萤火虫荧光素酶(Firefly luciferases，FL)与海肾荧光素酶(Renilla luciferases，RL)作为双报告基因，本论文构建了一种基于双荧光素酶报告基因的β2AR激动剂活性评价系统，利用该系统检测细胞内cAMP水平变化，重点分析了甘草次酸对β2AR、G蛋白(Gprotein)和腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)三个G蛋白偶联受体(Gproteincouplereceptor，GPCR)信号转导过程中关键分子的协同作用。结果表明，甘草次酸对β2AR激动剂异丙肾上腺素，G蛋白激动剂GppNHp，AC激动剂Forskolin具有不同程度的协同增效作用，但不能逆转特异性β2AR拮抗剂ICI118，551对β2AR的拮抗作用，证明β2AR的激活是必不可少的前提条件，因此推测甘草次酸的协同作用与β2AR的激活有直接的关系，从一定程度上解释了甘草在咳喘中药中配伍的科学内涵。　　 为了揭示甘草次酸的作用靶点，本论文成功的合成了可以用于荧光标记的甘草次酸叠氮化衍生物(azide-terminal glycyrrhetic acid，ATGA)，以及生物素炔基衍生物(biotin-LC-alkyne)和4-ethynyl-N-ethyl-1，8-naphthalimide荧光探针。通过点击化学的荧光示踪技术，结合激光共聚焦显微镜的观察，实时监测了甘草次酸衍生物的细胞定位和分布情况。结果显示，脂筏区标志性GM1蛋白和ATGA共同处于细胞膜的脂筏区，而甘草次酸会竞争性的降低ATGA在细胞膜脂筏区的分布。另外，ATGA与β2AR的共定位程度较低，表明了两者分布在细胞膜上不同的区域。　　 采用蔗糖密度梯度离心技术分离对各组分中胆固醇含量测量的结果表明，细胞膜中的胆固醇主要集中在脂筏区域；但在甘草次酸的作用下，脂筏区域的胆固醇含量明显的下降，而在相应的脂筏区中的甘草次酸标记物ATGA的含量增加，推测甘草次酸可能具有竞争性降低脂筏区中胆固醇含量的作用。此外，加入外源性的胆固醇可以有效的抑制了甘草次酸的协同增强的作用，从另一个角度也证明了甘草次酸和胆固醇的相互作用是协同增效作用的关键。膜流动性分析的ESR结果表明，0.1mM甘草次酸处理后的细胞膜序参数(S)没有显著性的变化，说明细胞膜浅层的流动性没有受到显著影响；相反在甘草次酸处理后，旋转相关时间tc为15.13±0.15 s，和对照组细胞16.03±0.11 s相比明显降低(p＜0.05)，说明细胞膜深层流动性明显增加；而S/W值从处理前的5.31±0.09降低为4.67±0.11，表明细胞膜蛋白构象发生了变化，表明蛋白分子在甘草次酸的作用下变得更加紧凑。　　 应用离子去污剂法（Triton X-100法）和非离子去污剂法(Na2CO3法)两种脂筏分离方法，研究了甘草次酸对β2AR信号通路中的相关信号分子在脂筏区域分布的影响。在非离子去污剂分离法中，甘草次酸可以使激活型的G蛋白的alpha亚基(Gαs)移出脂筏区域并移位到了非脂筏区域；在离子去污剂分离法中，甘草次酸也使得位于脂筏区的Gαs亚基和ACⅤ/Ⅵ转移到了非脂筏区域。上述结果均阐明了甘草次酸具有解除脂筏对Gαs等信号分子限制的能力。　　 综上所述，甘草次酸可以与胆固醇竞争性的结合在细胞膜的脂筏区，通过降低细胞膜胆固醇的密度，增加细胞膜内侧的流动性，改变了其中信号分子蛋白的构象，削减了脂筏对β2AR信号通路信号分子的限制，使得Gαs蛋白从脂筏区中游离出来，增加了β2AR和Gαs的偶联，使得β2AR由非活化状态转变成活化状态。由于处于活化状态的β2AR数量增加，当β2AR激动剂加入时导致cAMP的产量增加，因此信号的级联放大的效率增加。此研究结果揭示了甘草次酸与β2AR激动剂的协同增效的科学内涵。　　 文献研究已经证明，大量的细胞受体和脂类信号分子被募集在脂筏中，而脂筏主要通过改变信号分子在脂筏区和非脂筏区的分布来对各种刺激做出有效和具体的反应。许多复杂的信号传导通路都是通过在脂筏内发生不同的生物学效应来完成的。同时脂筏还参与了体内物质的跨膜运输、免疫细胞活化、胰岛素及Ca2+介导的信号传导等体内重要的生理过程。而本论文研究发现的甘草次酸可以结合在细胞膜的脂筏区，通过降低胆固醇的含量，改变细胞膜内侧的流动性，影响了细胞膜受体的活化状态，也为揭示甘草调和诸药充当“使药”的分子机制提供了重要线索。