骨骼干细胞（Skeletal stem cells,SSCs）是一群具有自我更新并分化产生软骨细胞、成骨细胞和基质细胞“三谱系”的组织特异性干细胞。作为骨发育过程中的重要事件,越来越多的证据表明骨骼干细胞在骨骼发育和损伤修复过程中发挥重要作用,其起源及表型和功能富集一直受到广泛关注。通过目的分选和遗传谱系示踪研究,多潜能和自我更新的骨骼干细胞陆续在早期出生后小鼠生长板、静息区和骨膜中鉴定出来。最新研究显示,骨骼干细胞也存在于17周的人类胎儿长骨生长板中。然而,骨骼干细胞在人类早期胚胎中的起源、分子特征及其调控机制仍不清楚。在本研究中,首先,我们选取了初级骨化中心发生前后,孕5周人类胚胎上下肢芽及孕8周四肢长骨进行单细胞转录组高通量测序。肢芽和长骨的整合分析鉴定发现了16个主要细胞类群。其中肢芽样本富集显著异质性的间质细胞和上皮细胞类群,且通过已知的标志基因我们在转录组上进一步将肢芽沿着近端-远端和前端-后端轴进行匹配分析;而长骨样本则富集软骨细胞和成骨前体细胞类群。此外,根据非监督分层聚类分析、主成分分析及假时序分析,我们在肢芽和长骨样本中发现高表达TWIST2和PDGFRA的的成骨-软骨祖细胞（Osteo-chondrogenic progenitor,OCP）,提示最早的骨骼干祖细胞可能包含于其中。其次,我们通过对胚胎长骨的成骨-软骨祖细胞进一步分群聚类,在转录组上得到了3群干祖细胞类群,包括肢芽来源的TWIST2+间质细胞、高表达CXCL2和PDGFRA的骨髓基质细胞、以及一群具有分化为软骨细胞和成骨前体细胞潜能的胚骨骼干祖细胞（e SSPCs）。转录调控网络分析发现,胚骨骼干祖细胞富集转录因子FOXP1/2网络。免疫荧光染色进一步显示FOXP1/2+细胞主要定位于软骨膜外层和新生的初级骨化中心内部,这也与此前在小鼠中发现的软骨外膜前体细胞非常相似。随后,通过差异基因筛选,我们明确了一组用于分选富集胚骨骼干祖细胞群体的细胞表面标志物:PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+,并发现其具有较强的体外克隆形成能力。连续性克隆传代及体内外分化实验证明,胚骨骼干祖细胞具有自我更新和成软骨、成骨分化潜能,但无法维持造血微环境。此外,我们对孕8周人类胚胎脑颅骨进行了单细胞转录组测序,发现了一群同样具有相似表型:PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+的神经嵴源性细胞（Neural crest derived cells,NCDCs）,其同样富集FOXP1/2转录因子网络,并在颅骨矢状缝和软骨膜内富集,暗示这群神经嵴源性细胞可能在颅骨发育和膜内成骨过程中发挥重要作用。综上所述,本研究首次绘制了早期人类胚胎骨骼形成过程中的单细胞图谱,是国际上首次针对早期人类胚胎骨骼干细胞起源的研究,从转录组和功能学层面鉴定了一群位于软骨膜外层的胚胎骨骼干祖细胞（e SSPCs）,揭示了人胚骨骼生成过程中的细胞异质性和谱系层级,有助于深入理解人类骨骼发育及损伤修复机制,为骨骼再生障碍性疾病的治疗提供了新思路。