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植物细胞全能性指植物的每个细胞都具有发育成完整个体所需的全部遗传信息,因而在合适的培养条件下能够再生完整新个体。植物细胞全能性也被认为是植物离体培养的理论基础。研究表明,多种遗传因素和物理因素能够影响植物细胞全能性的表达。在合适的离体培养条件下,植物的体细胞可以经过细胞脱分化和再分化过程形成与合子胚形态类似的结构,称为体细胞胚。体细胞胚胎发生长期以来作为研究胚胎发生的一个模式系统,被认为是植物细胞全能性的完全表现。目前,体细胞胚的起源问题一直是科学家们研究的重点,对于体细胞胚是单细胞起源还是多细胞起源,以及是直接发生还是间接发生目前仍没有明确的结论。体细胞胚的起源存在怎样的调节机制,如何将已经分化的植物体细胞转变成具有完全不同的结构、功能及发育命运的全能干细胞?深入研究体细胞胚的起源及体细胞胚胎发生的分子机制,并鉴定在此过程中的调节因子及分析它们的相互关系,从而建立一个诱导植物细胞全能性表达的基因调控网络,将为进一步理解植物细胞全能性调控的分子机理提供重要信息。主要研究结果如下:(1)单细胞起始的体细胞胚胎发生为深入分析体细胞胚起始过程中的基因调控,解析调节植物细胞全能性的分子网络,我们建立了以拟南芥子叶细胞诱导体细胞胚胎发生的系统。该系统不经过胚性愈伤组织的形成,仅过表达胚胎特征基因LEAFYCOTYLEDON2(LEC2),就能够由转基因幼苗子叶叶尖表皮细胞直接发育成体细胞胚。通过扫描电镜及半薄切片观察,发现体细胞胚是由单个细胞起始发生,该细胞为全能干细胞(Totipotent Stem Cell)。(2)全能干细胞的分子特征在体细胞胚起始发生的过程中,研究了胚胎特征基因LEC1和SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1)的表达模式,发现它们都特异的在全能干细胞中表达;通过对生长素响应启动子DR5、生长素合成关键酶基因YUCCA 4 (YUC4)及细胞分裂素响应启动子TCS的表达模式进行分析,发现它们均特异的在全能干细胞中表达,暗示生长素和细胞分裂素对全能干细胞的产生有重要的调节作用。利用分子标记观察体细胞胚胎发生过程中子叶表皮细胞转变成全能干细胞的微丝骨架及内质网的动态变化。发现已分化的子叶表皮细胞中的微丝以聚合状态存在,而全能干细胞中的微丝则以解聚状态存在;内质网在已经分化的子叶表皮细胞中以片状及管状两种状态存在,而在全能干细胞中则主要以短管状居多,说明全能干细胞的分化程度更低。(3)细胞全能性分子调控网络的建立以SERK1作为标记基因,利用荧光捕获技术特异的获取体细胞胚胎发生早期的全能干细胞,将其周围细胞和未诱导体细胞胚的子叶细胞作为对照,进行RNA-Sequence分析。得到2078个特异的在全能干细胞中高水平表达的基因。通过生物信息学的方法分析这些基因的上下游调控关系,初步建立了一个细胞全能性调控网络。该调控网络包含56个基因,其中转录因子有24个。根据基因的表达水平和相互关系将它们在网络中的位置分为三个区域:处于第一区域(最核心区域,红色区域)的调控因子共有8个,主要作为转录因子调控其他基因的转录,其中包括已知的能够调控细胞全能性表达的LEC2和ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3 (ABI3)等;以最核心区域的因子为发散点,在第二区域(橙色区域)有33个调控因子与第一区域关系紧密,其中包括已知的能够调控细胞全能性表达的MYB DOMAIN PROTEIN118 (MYB118)和PICKLE(PKL)等;而第三区域(绿色区域)有15个调控因子,它们与第二区域的因子调节关系较为紧密。(4)重要调控因子的功能分析对调控网络中关键调控基因的表达模式和功能进行研究,发现大部分基因如CUP-SHAPED COTYLEDON 1 (CUC1)、TOTIPOTENCY1 (TP1)和 TP2 等不仅特异的在全能干细胞中表达,也在合子胚的发生过程中表达,说明这些全能性调控因子也参与调节合子胚胎发生;而分别过表达HYDROXYSTEROIDDEHYDROGENASE1(HSD1)、TP1和TP2都能够诱导体细胞胚的产生,证明这些基因都能够调控植物细胞全能性表达。除了对调控网络中的基因进行功能鉴定,我们还根据RNA-Sequence的转录组分析结果鉴定出一些功能未知的在全能干细胞中特异高水平表达的基因,如UNKNOWN TOTIPOTENCY 1 (UTP1)和UTP2。表达模式和功能分析结果显示,它们特异的在全能干细胞中表达,并能够调控合子胚的发育。我们还将已知的动物细胞全能性调控因子与我们通过RNA-Sequence分析得到的全能干细胞特异表达的基因进行序列同源性比对,鉴定到同源性较高的基因TOTIPOTENCY IN ANIMAL 1(TPA1)、TPA2、TPA3和TPA4,进一步证明这些基因对拟南芥合子胚的发育也具有调控作用,说明全能性调控因子可能在动物和植物细胞中具有功能保守性。