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作为激活胞外级联通路的重要组成部分,clip丝氨酸蛋白酶基因(clip-domain serine proteases,CLIPs)在昆虫变态发育和免疫生理过程中发挥着重要作用。本研究以重要仓储害虫烟草甲Lasioderma serricorne为研究对象,基于烟草甲转录组数据库克隆4个CLIPs基因(LsCLIP1、LsCLIP2、LsCLIP3和LsCLIP4),探讨其在烟草甲幼虫化蛹、先天免疫中的功能,对筛选有效的靶标来防治烟草甲具有重要意义。1.烟草甲LsCLIPs基因的克隆及序列分析利用RT-PCR技术克隆了烟草甲4个LsCLIPs基因,包括LsCLIP1、LsCLIP2、LsCLIP3和LsCLIP4的开放阅读框(open reading frames,ORFs),其ORFs长度分别是1194 bp,1194 bp,1173 bp和1158 bp,分别编码397,397,390和385个氨基酸,相对分子质量分别为44.3,43.4,43.0和42.3 kDa,等电点分别是6.18,5.19,5.85和6.10。通过SMART在线软件分析表明,4个LsCLIPs基因编码的氨基酸序列在N端分别含有起调控作用的clip结构域,每个clip结构域含有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,同时C端是一个典型的丝氨酸蛋白酶保守结构域(trypsin-like serine protease domain,Tryp_SPc domain),即含有TAAHC、DIAL和GDSGG三个保守的序列。运用软件DNAMAN 6.03将这4个LsCLIPs氨基酸序列与烟草天蛾Manduca sexta,赤拟谷盗Tribolium castaneum和冈比亚按蚊Anopheles gambiae进行多序列比对分析,结果表明烟草甲的4个LsCLIPs基因编码的氨基酸序列与上述物种的CLIPs基因编码的氨基酸序列有较高的同源性。运用软件MEGA的邻接法(neighbor-joining,N-J)进行聚类分析研究表明,LsCLIP1和LsCLIP2归属于subfamily C,LsCLIP3归属于subfamily B,LsCLIP4归属于subfamily D。2.烟草甲LsCLIPs基因的时空表达和20E调控模式采用qPCR技术解析烟草甲LsCLIPs基因的时空表达与外源激素20E调控模式。结果表明,不同LsCLIPs基因在不同发育阶段和不同组织部位的表达存在一定的差异,20E可诱导LsCLIPs基因高表达。其中,4个LsCLIPs基因在烟草甲各发育阶段均有表达,LsCLIP1和LsCLIP2在蛹期表达量最高,高龄成虫中表达量最低;LsCLIP3和LsCLIP4在低龄成虫中表达量最高,高龄成虫中表达量最低;不同组织部位表达模式解析表明,4个LsCLIPs基因在表皮中的表达量最高,其次是脂肪体和剩余组织,在肠道中的表达量最低。20E注射烟草甲4龄幼虫后,LsCLIPs基因的相对表达量较对照均升高,且在8 h表达量达到最高,mRNA表达量分别为对照的13.68,43.51,79.75和2.33倍,说明20E对4个LsCLIPs基因的表达具有诱导作用。3.象虫金小蜂寄生和肽聚糖胁迫对烟草甲LsCLIPs基因表达的影响运用qPCR技术解析象虫金小蜂Anisopteromalus calandrae寄生和肽聚糖胁迫后烟草甲LsCLIPs基因的表达变化。象虫金小蜂A.calandrae寄生烟草甲幼虫或蛹后,LsCLIP1、LsCLIP2和LsCLIP3基因表达量显著升高,而LsCLIP4表达量与对照相比无明显差异。对烟草甲4龄幼虫分别以大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的肽聚糖(PGN-EB和PGN-SA)进行免疫胁迫,进一步分析烟草甲体内4个LsCLIPs基因mRNA表达变化,结果表明:2种肽聚糖处理后,LsCLIP1、LsCLIP2和LsCLIP3的相对表达量在不同时间点均出现明显的升高,而LsCLIP4较对照无显著变化。4.基于RNA干扰的烟草甲LsCLIPs基因生理功能分析采用烟草甲5龄幼虫为试验材料,利用RNAi技术进一步对LsCLIPs基因的功能进行研究。结果表明,与注射dsGFP相比,分别注射4个LsCLIPs基因的dsRNA后,目的基因的表达量均显著降低,并出现存活率下降的现象,其中试虫致死表型大致可分为两大类:第一类是幼虫虫体局部黑化并呈现不正常的色素沉积;第二类是幼虫虫体全黑化,且虫体严重畸形。LsCLIPs基因表达的下降导致大部分试虫出现蜕皮困难而死亡。研究结果说明4个LsCLIPs基因对烟草甲的蜕皮、变态和发育具有重要作用。RNAi结合大肠杆菌生物测定,选择RNAi沉默120 h(显著抑制)进行大肠杆菌注射,发现RNAi处理组(dsLsCLIP1、dsLsCLIP2和dsLsCLIP3注射组)与对照组相比,死亡率均显著升高,而dsLsCLIP4注射组较对照无显著变化。研究结果说明LsCLIP1、LsCLIP2和LsCLIP3基因参与烟草甲对大肠杆菌的先天免疫。综上所述,本研究基于烟草甲转录组数据,克隆获得烟草甲4个LsCLIPs基因全长cDNA序列,采用qPCR技术分析其时空表达模式、外源激素20E处理、象虫金小蜂寄生和肽聚糖(PGN-SA和PGN-EB)免疫胁迫后的表达模式,最终运用RNAi及生物测定技术研究其在烟草甲蜕皮发育和先天免疫过程中的功能。研究结果为烟草甲的防治提供理论依据。