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自然流产系指妊娠不到28周、胎儿体重不足1000g、胎儿及其附属物脱离母体而自然中止者，其发生率占人类妊娠的12％～15％。当自然流产连续发生3次以上时则称为反复性自然流产(recurrentspontaneousabortion，RSA)。妊娠早期反复自然流产(Earlyrecurrentspontaneousabortion，ERSA)指妊娠12周内反复发生的自然流产。据统计，人类妊娠大约70％不成功，50％左右的受精卵在下次月经来潮之前就发生了流产，即所谓临床前流产。这种流产可能并未被本人察觉而仅仅认为是一次血量偏多的正常月经或延期月经。一些回顾性研究和前瞻性研究均指出临床可诊断的妊娠在前三个月内的自然流产为10％～15％，ERSA的发生率为2％～5％。真正能够发育成熟正常分娩者仅占人类妊娠的25％左右。由此可见，人类流产的发生率相当高。导致反复性自然流产的原因很多，而且约有一半的早期流产原因不明。因此，探讨自然流产的病因，对于生殖与避孕具有十分重要的意义。本研究共分为三个部分，其主要实验方法和实验结果如下：
第1章反复自然流产的细胞和分子细胞遗传学研究及干预本部分的研究工作旨在建立一个从细胞到分子细胞水平的技术平台，可以检测自然流产中各种染色体异常，包括染色体微小结构异常及染色体复杂重排，并可对染色体异常导致自然流产在胚胎着床前进行干预。首先，我们对1780名于孕28周前自然流产的患者进行细胞遗传学检查；在此基础上，对其中两例疑有染色体微小易位的病例，采用显微切割获得的亚端粒探针，11q23.3→qter(两个病例均用此探针)、12q24.1→qter、22q13.1→qter，通过双色FISH技术分别对这两个病例的中期染色体进行确诊；对1例细胞遗传学检测无法确诊的染色体复杂重排，采用显微切割技术自制5号、16号长臂和20号短臂染色体特异性探针，应用正相和反相染色体涂染技术进行确诊；最后，为了治疗因染色体异常导致的自然流产，本部分对15例染色体结构异常携带者进行了胚胎植入前遗传学诊断助孕的尝试。结果表明，在1780例具有自然流产史的夫妇中，发现异常核型57例，异常率为3.2％；其中男性21例，占2.40％(21/874)，女性36例，占3.97％(36/906)，女性染色体异常者高于男性(P＜0.05)；流产3次或以上者与流产1次和2次者比较，染色体异常发生率显著增高(P＜0.01，而流产1次和2次者之间染色体异常发生率无差别。对于其中两例疑有染色体微小易位的病例，通过FISH确定其核型分别为：46,XX，t(11；12)(q25；q24.2).isht(11；12)(TBP11+，TBP12+；TBP11+,TBP12+)；46，XY,t(11；22)(q25；q13.3).isht(11；22)(TBP11+，TBP22+；TBP11+,TBP22+)。通过正相和反相染色体涂染技术，确定1个涉及5号、16号及20号染色体复杂重排的核型为：46,XY,t(5；20；16)(q35；p13；q12)，ins(5；20)(q35；p11p13).isht(5；20；16)(CAP5q+,CAP20p+，CAP16+；CAP5q+,CAP20p+；CAP16q+,CAP20p+)，ins(5；20)(CAP5q+；CAP20p+)。对15例PGD检测的初步结果表明，9号染色体臂间倒位组男女携带者植入率及临床妊娠率之间无显著差异；男、女罗氏易位携带者活检胚胎率和异常胚胎比率无显著差异，但单体胚胎、其它异常胚胎(包含除三体、单体和2倍体之外的其他混乱的异常信号)、移植胚胎比率之间差异显著。结果证实了染色体异常是导致自然流产的重要原因，分子细胞遗传学技术不但可以确诊染色体微小结构异常，而且对在染色体复杂重排核型的确诊上具有重要意义。应用胚胎植入前诊断技术，可以解决染色体异常导致的自然流产问题，是一种积极性的优生途径。
第2章比较基因组杂交技术在反复自然流产中的应用研究表明胚胎发育过程中染色体发生异常改变的几率远大于RSA夫妇染色体异常的发生率，胚胎自身染色体的异常是导致RSA发生的主要原因之一。为了解遗传因素在RSA中的可能影响，进一步阐明其发病机制，本研究收集早孕3个月内发生反复自然流产2次以上患者(排除其它病因)的流产胚胎标本15例，采用比较基因组杂交技术对其进行研究。以正常男性健康志愿者外周血淋巴细胞制备正常中期染色体。用红色荧光染料标记商业购买的胎盘DNA，作为正常参照DNA。抽提流产标本的绒毛组织DNA，用绿色荧光标记。用标记好的待检组织DNA和参照组DNA探针同时与正常中期染色体玻片杂交，用蔡氏荧光显微镜(ZeissAxioplan2)观察杂交好的中期染色体分裂相，获取数据并分析。结果显示，15例流产胚胎经CGH核型分析，6例胚胎染色体正常，9例胚胎染色体出现异常，异常率为60％。包括2例19号染色体部分缺失、2例性染色体缺失(X单体)，以及X染色体重复(核型可能为47，XXY)、22号染色体重复、16号染色体重复、9号染色体重复及Y重复各1例(重复：gain，缺失：loss)。结果还显示反复自然流产的胚胎发生染色体异常与母亲年龄无关。结果表明，胚胎染色体异常是导致ERSA发生的主要原因之一，比较基因组杂交技术在反复自然流产胚胎的病因诊断中具有临床应用价值。从CGH结果还可以推断出，在胚胎染色体异常中，三体的发生率最高，这与传统的细胞遗传学方法检测流产胚胎的染色体结果一致。
第3章应用蛋白质芯片技术研究反复自然流产的发病机制胎儿作为一种同种的半异体抗原能够在母体内生存、生长和发育而不被排斥，母胎界面的特殊免疫状态发挥关键作用，而细胞因子在维持母胎界面这一特殊免疫现象中起着重要作用。为了了解早期妊娠7～8周正常妊娠蜕膜中相关细胞因子的表达规律，从蛋白表达水平探讨该妊娠时期内导致自然流产可能的发病机制，本研究比较了孕早期同阶段反复自然流产蜕膜与正常对照组中细胞因子的差异表达。研究中所选取的标本为被诊断为不明原因反复自然流产、年龄为28～32岁的患者于孕7～8周胚胎停止发育时的流产蜕膜组织6例，以及相同年龄段孕产史正常，因停经7～8周到我院门诊要求人流的6名志愿者的蜕膜组织。正常和异常蜕膜组织被分别分成两组，采用蛋白提取试剂盒提取蛋白质。以正常组为对照，用细胞因子抗体芯片同时对两组蜕膜组织中78种细胞因子的表达进行检测，经标化和组内、组间比较后发现：在检测的78种细胞因子中，病人Ⅰ组中有27种细胞因子表达较正常Ⅰ组上调2倍以上；病人Ⅱ组与正常Ⅱ组进行对照，有23种细胞因子表达上调2倍以上；在两组病人中均表达上调2倍以上的细胞因子共有20种：IL-8、IL-13、INF-γ、GRO、MCP-2、MIP-1、RANTES、SDF-1、TARC、TNF、EGF、IGF-1、Angiogenin、OncostatinM、VEGF、PDGF-BB、HGF、IGFBP-1、PARC、PIG；其中VEGF在正常组中均无表达，在患者组织中均有一定水平的表达；两组病人中有GRO、Angiogenin、PDGF-BB、IFN-γ3种细胞因子表达较正常组上调10倍以上；而表达上调5倍～10倍的细胞因子有5种：IFN-γ、EGF、OncostatinM、MIP-1beta、IL-8；表达上调2倍～5倍的细胞因子有11种：SDF-1、PIGF、HGF、IL-13、MCP-2、RANTES、IGF-I、TNF-beta、PARC、TARC、IGFBP-1。上述结果表明，VEGF过早或过高表达可能与早期自然流产相关；反复自然流产蜕膜中部分细胞趋化因子及血管生成因子表达增高，而细胞因子GRO、Angiogenin、PDGF-BB、IFN-γ表达显著上调，可能在妊娠早期反复自然流产的发生过程发挥极为重要的作用。