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背景与目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的肝脏原发性恶性肿瘤,其发病机制仍未完全阐明。SUMO化(small ubiquition related modifier,SUMO)是细胞中普遍存在的一种蛋白质翻译后修饰方式,SENPs(SUMO-specific proteases,SENPs)通过将SUMO蛋白从靶蛋白移除调控去SUMO化过程,参与基因的转录调控和信号转导等。研究发现SENP1(SUMO-specific protease1,SENP1)可以维持肝癌干细胞的干细胞特性,促进肿瘤形成;但有关其上游调控因子目前还不清楚。大量研究表明:多种小分子非编码RNA(miRNA)通过与靶mRNA的3’末端非翻译区(3’UTR区)相互作用负调节基因表达参与HCC的发生发展。研究显示miR-29a可发挥抑癌基因的作用并在包括HCC在内的多种恶性肿瘤中呈低表达。我们假设miR-29a可能通过某种机制调控SENP1的表达抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。本实验首先研究HCC中SENP1和miR-29a的表达水平,进一步探讨了两者对肝癌细胞增殖和侵袭的影响,并利用生物学实验验证SENP1是miR-29a的靶蛋白。通过本研究进一步了解肝癌的分子发病机制,为肝癌的诊断和治疗提供新的思路。方法1.通过免疫组化(IHC)、蛋白印迹(WB)及实时荧光定量PCR(qPCR)检测HCC中miR-29a和SENP1表达情况。2.构建SENP1-RNAi慢病毒载体和miR-29a mimics,分别转染MHCC97H及SMMC7721细胞,并进一步采用WB和qPCR分别检测miR-29a和SENP1的表达。3.运用Edu、细胞周期、克隆形成实验检测转染后SENP1和miR-29a对MHCC97H及SMMC7721细胞增殖能力的影响;蛋白印迹方法检测cyclinA2、cyclinE1的表达。4.采用流式细胞术检测转染后SENP1和miR-29a对肝癌细胞凋亡能力的影响。5.通过Transwell及划痕实验检测转染后SENP1和miR-29a对肝癌细胞侵袭、迁移能力的影响;蛋白印迹检测MMP2、MMP9蛋白表达水平。6.miRNA数据库预测靶基因,进一步通过双荧光素酶报告实验和蛋白印迹对其进行验证。结果1.免疫组化显示SENP1在HCC组织中呈高表达,在非肝癌癌组织中低表达;与人永生化正常肝细胞L02相比,SENP1在HCC细胞中呈高表达,而miR-29a呈低表达。2.成功构建SENP1-RNAi慢病毒稳转株,WB和qPCR显示转染慢病毒后肝癌细胞中SENP1的蛋白及mRNA水平表达下调。3.成功构建miR-29a表达上调的肝癌细胞,qPCR显示转染miR-29a mimics后肝癌细胞中miR-29a表达上调,而SENP1 mRNA水平无明显变化;WB显示转染后SENP1蛋白水平下调。4.Edu增殖实验、细胞周期实验显示,敲低SENP1或上调miR-29a表达后,肝癌细胞MHCC97H和SMMC7721发生S期阻滞,细胞增殖能力减弱;细胞克隆形成实验显示,敲低SENP1表达后,肝癌细胞MHCC97H和SMMC7721的克隆形成能力减弱;同时引起相关细胞周期调控蛋白cyclinA2、cyclinE1的表达下调。5.细胞凋亡实验显示,敲低SENP1或上调miR-29a表达后,肝癌细胞MHCC97H和SMMC7721的凋亡增多。6.Transwell实验和划痕实验显示,敲低SENP1或上调miR-29a表达后,肝癌细胞的侵袭和迁移能力减弱;同时MMP2、MMP9的蛋白水平呈低表达。7.TargetScan、PicTar和microRNA.org靶基因预测网站均存在miR-29a与SENP1的3’UTR的结合位点,双荧光素酶报告实验进一步显示miR-29a mimics能抑制野生型SENP1报告基因载体荧光素酶的活性,而对突变型抑制作用不明显。结论1.HCC组织和HCC细胞中SENP1表达上调,miR-29a在HCC细胞中呈低表达。2.下调SENP1的表达可以抑制肝癌细胞MHCC97H、SMMC7721的增殖、侵袭能力,并诱导其凋亡,同时引起MMP9、MMP2、cyclinE1、cyclinA2的蛋白水平表达下调。3.miR-29a可靶向调节SENP1在肝癌细胞中的表达,抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。