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研究背景和目的Cereblon(CRBN)是cullin-4 RING E3泛素连接酶(CRL4)复合体的底物受体,促进底物蛋白与泛素分子的连接而实现泛素化,进而通过泛素-蛋白酶体系统行降解底物。原癌基因蛋白c-Jun是活化蛋白Activated protein-1(AP-1)转录因子复合体的重要组成成分之一,AP-1活性的提高可以促进炎症反应。一种调控AP-1活性的机制是调控AP-1复合体各组成成分的表达以及活性,尤其是原癌蛋白c-Jun。在我们的前期工作中,我们通过质谱数据分析发现CRBN过表达能够下调c-Jun的蛋白水平。随后的工作中我们进一步证实了CRBN通过促进c-Jun泛素化而对其降解。c-Jun/AP-1位于炎症反应信号通路的下游,因此我们猜想CRBN是否能够通过调控c-Jun/AP-1活性而参与到炎症反应的调控中来。尽管目前有文献报道显示CRBN能够调控炎症反应,但是这一作用与CRBN组成的E3泛素连接酶的酶活功能无关。那么CRBN参与的炎症反应是否与CRBN及相关的E3泛素连接酶活性相关呢?在本课题中我们将通过一系列实验验证CRBN及相关的E3泛素连接酶是否也参与了炎症反应的调控,其对炎症反应的调控是否影响细胞凋亡。研究方法构建GFP、CRBN的稳转HEK293T细胞株。利用细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)以及质谱分析法对蛋白进行定性定量分析,通过蛋白数据库搜索获得过表达GFP组与CRBN组的细胞中蛋白水平明显发生变化的蛋白,发现CRBN明显下调c-Jun蛋白水平。随后我们用生化实验验证质谱分析的结果,通过免疫印迹法进一步在HEK293T细胞以及CRBN敲除小鼠大脑组织中证实CRBN对c-Jun蛋白表达水平的调控。接着我们用免疫共沉淀、免疫荧光共定位及免疫印迹法检测c-Jun与CRBN是否存在相互作用。同时用生物化学方法探究CRBN调控c-Jun蛋白泛素化、稳定性的分子机制。在炎症细胞中用双荧光素酶报告基因检测系统、q-PCR实验和蛋白免疫印迹法检测CRBN对c-Jun/AP-1活性以及炎性相关介质如IL-1β、IL-6、i NOS和COX-2等m RNA或蛋白水平的影响,此外我们在LPS诱导的THP-1巨噬细胞中用流式细胞仪实验检测CRBN对细胞凋亡的影响,并探索这一调控是否与c-Jun/AP-1有关。研究结果对前期的质谱数据进行分析,我们发现CRBN能够下调c-Jun蛋白表达水平。通过生物化学实验我们证实了CRBN对c-Jun的调控关系。HEK293T细胞中过表达CRBN能够明显下调c-Jun蛋白水平,在加入蛋白酶体抑制剂MG132处理后发现CRBN诱导的c-Jun蛋白下降得到明显回升。沉默CRBN的HEK293T细胞或CRBN敲除的小鼠大脑组织中c-Jun蛋白水平明显上升。蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理后CRBN过表达组中c-Jun蛋白的半衰期明显缩短。同时q-PCR实验发现CRBN并不影响c-Jun的m RNA水平。蛋白质泛素化检测实验发现,与阴性组相比,CRBN过表达后明显增强c-Jun的泛素化水平,且主要形成K48位多聚泛素链。在炎症细胞模型中,双荧光素酶报告基因实验发现,与对照组进行对比,CRBN过表达能够明显下调AP-1的转录活性。通过q-PCR实验进一步发现,CRBN能够下调脂多糖(LPS)诱导的炎症反应,当细胞用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理以及c-Jun敲低后,CRBN的过表达及敲低对炎症反应的调控完全受阻。流式细胞实验发现CRBN能抑制LPS诱导的细胞凋亡。研究结论质谱数据分析发现CRBN能够调控c-Jun蛋白表达。生化实验证实CRBN与c-Jun存在相互作用,并且CRBN能够通过上调c-Jun的泛素化水平而促进c-Jun通过泛素-蛋白酶体系统降解,使c-Jun的稳定性降低进而使转录因子AP-1复合体活性降低,最后产生抑制炎症反应和对抗细胞凋亡的作用。本文证实了CRBN对炎症反应以及细胞凋亡的调控,并阐明了其调控的分子机制。