研究背景:心肌纤维化常见于高血压、心肌梗死、风湿性心脏病等多种心血管疾病。目前临床上缺乏心肌纤维化的有效干预措施,主要是由于心肌纤维化的形成和发展的调控机制尚不明确。研究发现,巨噬细胞可以通过分泌炎症因子、生长因子、趋化因子、基质金属蛋白酶等多种因子参与心肌纤维化。根据心肌组织中巨噬细胞的不同来源,可将其分为骨髓单核细胞来源的巨噬细胞和卵黄囊来源的心脏驻留巨噬细胞。研究发现,两者在心肌再生、早期心脏血管形成等方面有着显著的差异,但是两者在心肌纤维化方面的作用还没有研究报道。因此,明确不同来源的巨噬细胞在心肌纤维化中的作用对于进一步认识纤维化的形成机制有着重要意义。研究目的:本实验利用小鼠主动脉弓缩窄模型进行实验研究,探讨不同来源巨噬细胞在左室压力超负荷早期心肌纤维化中的作用。研究方法:1.第一部分1.1选用8～10周龄、体重20～25g的雄性C57BL/6J小鼠40只分为(n=10):(1)假手术组(SHAM)、(2)缩窄3天组(TAC3D)、(3)缩窄7天组(TAC7D)、(4)缩窄14天组(TAC14D)。各缩窄组小鼠行主动脉弓缩窄术,假手术组除不缩窄主动脉弓部,其他操作同各缩窄组;1.2.采用小动物心脏超声检测左室射血分数评价小鼠心脏功能;1.3.采用小鼠心脏质量与体质量的比值和心肌细胞直径大小来评价心肌结构代偿性改变;1.4.采用石蜡切片Masson染色,在光镜下观察心肌纤维化情况;1.5.采用缺氧探针免疫组化染色评价心肌组织微环境缺氧程度。2.第二部分2.1选用8～10周龄、体重20～25g的雄性C57BL/6J小鼠40只分为(n=10):(1)Vehicle+假手术组(Vehicle+SHAM)、(2)Vehicle+缩窄14天组(Vehicle+TAC14D)、(3)CCR2Inhibitor+假手术组(CCR2 Inhibitor+SHAM)、(4)CCR2 Inhibitor+缩窄14天组(CCR2Inhibitor+TAC14D)。2.2.采用冰冻切片免疫荧光染色,使用抗F4/80抗体标记巨噬细胞,使用抗CD31抗体标记血管内皮细胞,观察巨噬细胞在心肌组织中的分布;2.3.采用流式细胞术检测心肌组织单细胞悬液中不同来源巨噬细胞亚型的比例变化;2.4.采用石蜡切片Masson染色,在光镜下观察心肌纤维化情况;2.5.采用缺氧探针免疫组化染色评价心肌组织微环境缺氧程度。3.用Graph Pad Prism 6.0软件行统计学分析,所有数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,p<0.05时认为具有统计学差异。结果:第一部分:左室压力超负荷模型的建立及其早期心肌纤维化的病理学变化1.小鼠术后存活情况:缩窄组小鼠主动脉弓缩窄术后2周内死亡率为6.7%(2/30),假手术组术后2周内无1例死亡。2.小鼠心脏超声检测结果:与假手术组相比,缩窄14天组小鼠心脏左室射血分数及左室短轴缩短分数没有显著变化,差异无统计学意义(p<0.05),提示在缩窄14天小鼠心脏功能尚处于代偿阶段。3.左室压力超负荷早期小鼠心肌结构出现的代偿性变化情况:与假手术组比较,各缩窄组小鼠心脏质量与体质量之比均显著增大(p<0.05);采用麦胚凝集素标记心肌细胞膜,冰冻切片免疫荧光染色发现,与假手术组比较,各缩窄组小鼠心肌细胞直径均显著增大(p<0.05)。4.左室压力超负荷早期心肌纤维化动态病理学变化情况:Masson染色显示左室压力超负荷早期心肌纤维化主要出现于血管周围;与假手术组相比,各缩窄组均出现明显血管周围纤维化(p<0.05),且缩窄后3、7、14天血管周围纤维化程度呈加剧趋势。5.左室压力超负荷早期心肌组织微环境缺氧变化情况:取小鼠心脏横截面进行石蜡切片,缺氧探针免疫组化染色显示,在左室压力超负荷早期,随着管周纤维化的出现,心肌组织微环境的缺氧情况也发生明显变化,与假手术组相比,各缩窄组小鼠心肌组织微环境缺氧程度显著加剧(p<0.05)。第二部分不同来源巨噬细胞在左室压力超负荷早期心肌纤维化中作用的研究1.左室压力超负荷早期巨噬细胞在心肌组织中的分布变化情况:使用anti-F4/80抗体分别标记巨噬细胞、使用anti-CD31抗体标记血管内皮细胞,免疫荧光染色结果显示,在左室压力超负荷早期,巨噬细胞主要出现于心肌组织血管周围;与假手术组相比,各缩窄组小鼠心肌组织中的血管周围均出现明显的巨噬细胞聚集现象。2.左室压力超负荷早期不同来源巨噬细胞亚型的变化情况:使用流式细胞术分别检测假手术组和缩窄14天组小鼠心肌组织的单细胞悬液发现,与假手术组相比,缩窄14天组CCR2+巨噬细胞比例明显增加(p<0.05)。3.使用CCR2抑制剂干预实验小鼠,发现CCR2抑制剂可以使缩窄组小鼠心肌组织中聚集在血管周围的巨噬细胞减少;可以有效减少缩窄组小鼠心肌组织单细胞悬液中CCR2+巨噬细胞的比例(p<0.05);可以有效降低缩窄组小鼠心肌组织血管周围纤维化的程度(p<0.05);可以在一定程度上缓解缩窄组小鼠心肌组织微环境的缺氧情况(p<0.05)。结论:1.心肌组织中血管周围纤维化是左室压力超负荷早期出现的显著病理学变化;2.在左室压力超负荷早期,心肌组织血管周围有大量巨噬细胞浸润,心肌组织中单核细胞来源的巨噬细胞比例明显增加,减少其比例后可在一定程度上缓解血管周围纤维化的进展。提示单核细胞来源的巨噬细胞可能是干预心肌纤维化的一种靶细胞。