哺乳动物卵母细胞的玻璃化冷冻保存对胚胎生物技术的研究,优良种畜和濒危动物种质资源的保存具有重要意义。但其解冻后卵母细胞的受精率及发育能力显著低于新鲜卵母细胞,严重限制了该技术的应用。其原因在于,玻璃化冷冻会引起卵母细胞胞内Ca²⁺([Ca²⁺]i)浓度异常升高,但目前升高的机制仍不清楚,因此,本研究从胞内钙库（内质网,线粒体）角度和分子水平探究了玻璃化冷冻牛卵母细胞Ca²⁺浓度升高的来源,同时应用Ca²⁺调控物质BAPTA-AM（或BAPTA）和钌红（RR）,研究了其对冷冻牛卵母细胞受精和发育能力的影响。研究结果如下:1、体外成熟的牛MII期卵母细胞经不同处理分为新鲜、乙二醇（EG）、二甲基亚砜（DMSO）、冷冻液处理和冷冻五组,用染色的方法分析了其[Ca²⁺]i、内质网Ca²⁺(ER Ca²⁺)、线粒体Ca²⁺(mCa²⁺)的水平,以及新鲜、冷冻液处理和冷冻组内质网和IP3I型受体（IP3R1）的形态分布,结果表明玻璃化冷冻会使牛卵母细胞[Ca²⁺]i、mCa²⁺水平升高,ER Ca²⁺浓度降低（主要由冷冻液中的DMSO引起）,内质网及IP3R1分布异常（P<0.05）。2、牛MII期卵母细胞用含0.5、1、2μM RR的体外成熟液处理0.5 h,新鲜组和玻璃化冷冻组作对照,分析RR处理对冷冻牛卵母细胞Ca²⁺浓度、ATP含量、线粒体膜电位（ΔΨm）水平、凋亡及发育潜力的影响。结果表明RR处理能显著降低冷冻牛卵母细胞mCa²⁺浓度（P<0.05）,使较多的Ca²⁺留在胞质中,对ER Ca²⁺浓度无显著影响;1μM RR处理组卵母细胞的ATP含量、ΔΨm水平、未凋亡比例以及孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚率都显著高于冷冻组（P<0.05）,与新鲜组差异不显著。3、成熟20～22 h的牛卵母细胞用含5、10、20μM BAPTA的成熟液处理2 h,新鲜组和冷冻组作对照,分析其Ca²⁺浓度、皮质颗粒（CGs）分布、受精和发育能力。结果BAPTA处理能显著降低冷冻牛卵母细胞[Ca²⁺]i水平（P<0.05）,对ER Ca²⁺、mCa²⁺浓度无显著影响;10μM BAPTA处理能显著提高冷冻牛卵母细胞CGs环形分布和体外受精（IVF）时正常受精的比例,提高卵裂率（P<0.05）。10μM BAPTA和1μM RR联合处理能显著提高冷冻牛卵母细胞IVF后的卵裂率、囊胚率和囊胚质量（P<0.05）。4、收集新鲜组和冷冻组牛MII期卵母细胞进行转录组测序。结果得到102个差异基因（12个上调,90个下调）,两个Ca²⁺调节基因（CALM、SSRG）的mRNA表达在冷冻组中下调（P<0.05）;GO功能分析显示,差异基因主要在细胞组分中胞内膜结合的细胞器上富集（P<0.05）;qRT-PCR验证10个基因mRNA的表达模式,Western blotting分析CDK2和UCHL3蛋白的表达水平,均与Smart-seq2分析中一致。综上所述,本研究发现玻璃化冷冻会降低牛卵母细胞Ca²⁺调控基因（CALM,SSRG）的表达,引起ER Ca²⁺释放（主要由冷冻液中的DMSO引起）,导致[Ca²⁺]i和mCa²⁺水平增加,CGs提前释放、线粒体功能受损、凋亡比例升高,采用10μM BAPTA+1μM RR联合处理有助于缓解上述异常、进而提高冷冻牛卵母细胞的受精和发育能力。这些研究成果为提高玻璃化冷冻卵母细胞的效率提供了技术参考。