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背景与目的：急性白血病是一类起源于造血干细胞病变的恶性克隆性疾病，虽然近年来以大剂量化疗为主的综合疗法的广泛应用，使其治疗效果有了明显提高，但仍然有相当一部分患者因疾病复发或耐药而转变成难治，因此积极寻求新的治疗方法，在当前仍然显得尤为必要。目前受格列卫治疗慢性粒细胞白血病（CML）巨大成功的影响，分子靶向药物的研究正成为肿瘤治疗的领域的新热点，而这其中又以蛋白酶体抑制剂的研究更为引人注目。近年研究发现，蛋白酶体是一类广泛存在于所有真核细胞内具有多种催化功能的酶复合体，其在细胞内蛋白质降解、MHC-Ⅰ类抗原呈递、细胞内部错误折叠蛋白的修复上发挥着重要功能。多种与细胞周期调控、信号转导、细胞凋亡相关蛋白的正常代谢，都与其功能的正确执行密切相关。特异性阻断蛋白酶体功能将显著改变此类蛋白在细胞内的表达水平，导致细胞内蛋白质代谢发生紊乱，从而诱导细胞凋亡发生。目前作为第一个被FDA批准的蛋白酶体抑制剂类药物——硼替佐米（bortezomib，Bor）已经进入临床，并且在难治、复发性多发性骨髓瘤（MM）的治疗中显示出良好疗效。此外，在其他恶性血液系统疾病以及实体瘤方面，亦有初步结果报道：bortezomib单独或联合其它药物对非何杰金氏淋巴瘤（NHL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、成人T细胞白血病、肺癌、卵巢癌等具有良好疗效。目前，除MM外国际上对硼替佐米的研究较多局限于淋巴瘤、CLL，对于国内高发的急性髓系白血病方面的研究至今报道很少，为此我们探讨bortezomib对急性髓系白血病细胞增殖和凋亡影响，特别是与国内常用白血病化疗药物三尖杉酯碱（harringtonine，HT）、三氧化二砷（Arsenic trioxide，As2O3）联合应用的效果，旨在为今后白血病治疗探索新的方法。方法：选取HL60白血病细胞为研究对象，细胞培养体系为含10％小牛血清RPMI-1640培养基。为确定bortezomib对HL60白血病细胞的最佳处理浓度和时间，先用0～1000nM剂量体外处理HL60白血病细胞0～48h，依据台盼兰拒染计数法检测各浓度处理后细胞增殖状况，确定0～50nM剂量为后续实验浓度。bortezomib单独应用后细胞增殖活力变化采用MTT比色法检测，细胞凋亡采用DNA凝胶电泳、Hoechst33342荧光染色、流式细胞仪法检测。确定bortezomib作用24h为最佳处理时间。选择7.5～75nM HT和5～50μM As2O3处理HL60白血病细胞24h，分别确定其对细胞的IC50值。选择此剂量HT或As2O3与bortezomib联合处理HL60白血病细胞和8例AML患者骨髓单个核细胞(白血病细胞比例（56～95％），并用相同的方法检测各联合组细胞增殖、凋亡变化，统计分析各组间细胞增殖、凋亡之差异。结果：1．bortezomib对HL60白血病细胞增殖、凋亡的影响台盼兰拒染计数法显示：0、10、20、30、40nM bortezomib处理HL60白血病细胞6h，各浓度间活细胞数差异无显著性意义（P=0.461），延长作用时间到12小时，各浓度对HL60白血病细胞生长抑制效应逐渐显现，随时间延长和浓度增加，各处理组活细胞数逐渐减少，其中30nM剂量处理24h，可基本抑制HL60细胞增殖。MTT比色法显示：10～50nM bortezomib处理HL60细胞12～48h，各剂量组细胞增殖活性均出现下降。其中12h时，各组细胞活性分别降至对照组的82％、75％、60％、50％和44％。24h时，各剂量组细胞活性下降为对照的77％、46％、31％、24％和23％。与12h结果比较，差异均有显著性意义（P均＜0.05）。但与48h比，各组细胞活性未见明显下降，（P均＞0.05）。琼脂糖凝胶电泳显示：10～50nM bortezomib处理HL60细胞12h，电泳均可见DNA Ladder出现，其中10nM剂量组细胞凋亡不完全，可见正常基因组条带与DNA Ladder共存；处理24h时各剂量组仍可见DNA Ladder出现，但10nM组正常基因组条带消失。Hoechst33342荧光染色显示：10～50nM bortezomib均可诱导HL60白血病细胞凋亡，且每视野下高剂量组凋亡细胞数量明显多于低剂量组。流式细胞仪检测显示：培养12h对照组亚G1期细胞比例为1.9％，而10nM、30nMbortezomib处理组则分别为5.9％和59％，与对照组相比差异具有显著性意义（P均＜0.05）。延长处理时间至24h，对照组亚G1期细胞比例无明显变化，而10nM、30nM bortezomib处理组亚G1期细胞比例分别增加至19％和62％。与12h结果相比较，10nM组两处理时间之间结果具有显著性差异（P均＜0.05），但30nM组处理效果不受时间影响（59％：62％）。2．bortezomib联合三尖杉酯碱或三氧化二砷对HL60白血病细胞增殖、凋亡的影响MTT比色法显示：HT与As2O3单独应用对HL60白血病细胞同样具有浓度依赖性的抑制增殖作用。其对HL60白血病细胞24h的IC50剂量分别为30nM和15μM。选择此剂量HT、As2O3分别与10～50nM bortezomib联合处理HL60白血病细胞，在达到药物最大抑制效果前，10nM bortezomib联合HT或As2O3处理组细胞活性显著降至40％和33％，与同剂量单药组相比，差异均具有显著性意义（P均＜0.05）。Hoechst33342荧光染色显示：HT、As2O3单独应用均可诱导HL60白血病细胞凋亡，分别与bortezomib联合后，凋亡细胞数量显著多于药物各自单独处理时效果。流式细胞仪分析显示：30nM HT和15μM As2O3处理HL60白血病细胞24h，其凋亡亚G1期细胞比例分别为11％和19％，与对照组2％相比差异均具有显著性意义（P均＜0.05）。相同条件下，同剂量HT、As2O3与10nM bortezomib联合后，凋亡亚G1期细胞比例分别增至44％和47％，与各单药组效果相比差异同样具有显著性意义（P均＜0.05）。3．bortezomib联合三尖杉酯碱或三氧化二砷对急性髓系原代白血病细胞增殖的影响8例治疗前AML患者骨髓单个核细胞处理后显示：10～500nM bortezomib体外对急性髓系原代白血病细胞同样具有浓度依赖性的抑制增殖作用，随bortezomib剂量增加，各患者原代白血病细胞活力逐渐下降，但除500nM外，10～100nM剂量组之间细胞活力差异无统计学意义（P均＞0.05）。HT与As2O3单药对急性髓系原代白血病细胞同样具有浓度依赖性的抑制增殖作用，但与HL60白血病细胞株相比，同剂量HT（30nM）处理后，原代细胞增殖活力显著高于HL60白血病细胞株结果，而As2O3（15μM）处理后两者间无明显差异。20nM bortezomib联合30nM HT或15μM As2O3处理急性髓系原代白血病细胞后，其细胞活力均比单药时降低，但无统计学差异，（P＞0.05）。但是，bortezomib联合As2O3组与As2O3单药组细胞活性差异接近临界值（0.51：0.61，P=0.07）。结论：1．bortezomib单药对急性髓系HL60白血病细胞具有时间-浓度依赖性的抑制增殖和诱导凋亡作用，随时间延长和剂量增加作用显著增强。2．HT与As2O3单药对急性髓系HL60白血病细胞均具有剂量依赖性的抑制增殖作用，选其各自的IC50剂量分别与bortezomib联合处理后，对HL60白血病细胞的作用比各自单独应用时明显增强。3．bortezomib、HT、As2O3单药对急性髓系原代白血病细胞同样具有剂量依赖性的抑制增殖作用，但与HL60白血病细胞株结果相比，bortezomib、HT对原代白血病细胞敏感性弱，而As2O3敏感性无显著变化。4．bortezomib与HT或As2O3联合作用原代白血病细胞均具有抑制增殖作用，但与各自单用时比，联合HT的增殖抑制率无明显提高，而联合As2O3时很有可能优于单药As2O3处理的效果（P=0.07）。