颅咽管瘤是沿着颅咽管生长的上皮性肿瘤,占全年龄组颅内肿瘤的4.7%～6.5%,约占儿童颅内肿瘤的1/3。尽管颅咽管瘤在组织学上呈良性表现,但术后易复发；对周围重要结构影响大,术后遗留严重并发症等问题严重影响了患者的生存质量和存活期,因此被称为具恶性行为的良性肿瘤。颅咽管瘤是中枢神经系统最常发生钙化的肿瘤,成年人颅咽管瘤钙化率约60%,小儿颅咽管瘤则85%以上都有钙化。颅咽管瘤的钙化类型复杂,分布广泛是影响肿瘤手术并导致术后复发的一个重要因素,大量临床资料表明大块的肿瘤钙化灶常常与视交叉、三脑室底部、颈内动脉、鞍膈等结构紧密粘连,手术剥离为困难,稍有不慎往往造成严重的后果；如果不切除钙化,肿瘤的复发将成必然。然而,颅咽管瘤的钙化原因目前仍没有定论。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种与生理性、病理性钙化密切相关的分泌型的基质蛋白。OPN不但是骨骼和牙齿矿化细胞外基质的主要组成成分,在不同的组织细胞中均有发现。OPN既是一种黏附蛋白,又是一种细胞因子,其氨基端有9个天冬氨酸,组成一个高度酸性区域,对羟基磷灰石有结合能力,是联系骨细胞与羟基磷灰石间的“桥梁”。在OPN分子中10～12个门冬氨酸残基的重复序列,形成的强负电荷性是OPN与骨矿物质结合的重要结构基础,OPN与Ca2+有很高的亲和性,是骨矿化和磷酸钙结石形成的重要原因。本研究旨在通过对颅咽管瘤中OPN与钙化关系的研究寻找颅咽管瘤钙化的原因,以及OPN在颅咽管瘤中的作用机制,探索在临床手术治疗颅咽管瘤前进行干预,从而降低手术难度、提高肿瘤全切率、减少颅咽管瘤的复发。毕竟所有突破性的治疗手段的发明是建立在明确该疾病发病机制的基础上的。因此,研究OPN在颅咽管瘤钙化过程中的表达及调节机制具有重要的临床意义。临床资料与方法1.研究对象以2004年6月～2006年3月在我科进行手术治疗的颅咽管瘤病人为研究对象。入选患者共54例,其中男31例,女23例,年龄3-66岁,平均年龄26.5±18.4岁。病例纳入标准：①研究期间所有在我科进行手术治疗的颅咽管瘤患者；②术后病理证实为颅咽管瘤。2.实验处理本研究分两部分：一,收集颅咽管瘤标本,探讨OPN与颅咽管瘤钙化之间的量效关系：1.以术前的头部CT资料作为辅助,根据手术中所见颅咽管瘤钙化情况将颅咽管瘤的钙化程度分为4级：无钙化定为(一)；散在小点片状钙化定为轻度钙化(+)；蛋壳样钙化定为中度钙化(++)；大点片状、骨样钙化(直径>0.5 cm)定为重度钙化(+++)；2.运用免疫组织化学、Western Blot、RT-PCR等方法从蛋白、RNA层面检测肿瘤组织中OPN的表达量；3.运用免疫组化检测OPN受体CD44V6在颅咽管瘤组织中的表达情况。二,探讨颅咽管瘤的生物学特性：1.运用光镜及电镜观察两种类型颅咽管瘤的组织结构特征；2.运用免疫电镜观察颅咽管瘤细胞分泌OPN的组织学结构基础；3.运用免疫组化、Elisa等方法研究颅咽管瘤炎症与NF-κB相关信号通路激活的关系；4.通过形态学研究颅咽管瘤的骨化现象及成因。3.统计学处理用SPSS13.0版本统计分析软件对资料进行统计学分析。计量资料各项指标测定结果以均数±标准差(X±S)表示。两组间计量资料的比较用独立样本t检验。多组间资料比较满足方差齐性要求时采用单因素方差分析(ANOVA)检验,若差异有显著性,任意两组间比较用SNK(Student-Neuman-Keuls)法；若不满足方差齐性要求时用稳健方差分析(Welch)检验,组间用Tamhane’s T2法进行检验。对颅咽管瘤钙化程度与OPN与CD44V6表达量进行Mann-Whitney U和Spearman秩相关分析统计学分析,以P≤0.05为差异有显著性。结果①根据HE染色情况判断肿瘤类型,将其分为两种类型即成釉细胞型41例,鳞状细胞型13例。成釉细胞型的颅咽管瘤坏死的细胞形成大量湿性小节、纤维化、钙化、胆固醇沉积、肿瘤周围脑组织胶质增生严重等特征性的变化,而在鳞状细胞型颅咽管瘤中未见到相应的类似结构。②钙化均发生于成釉细胞型颅咽管瘤；鳞状细胞型颅咽管瘤未见明显钙化。③在钙化明显的成釉细胞型颅咽管瘤中OPN阳性细胞多为包绕在钙化周围的细胞。经Spearman秩相关分析,在成釉细胞型中随着钙化程度的增加,OPN表达程度显著增强(rs=0.533, P<0.001)。OPN在成釉细胞型颅咽管瘤中表达最为明显,主要在肿瘤细胞胞浆中,经Mann-Whitney U检验分析,OPN表达程度在成釉细胞型与鳞状细胞型之间存在显著差异(Z=-4.813,P<0.001)。④Western Blot结果发现鳞状细胞型颅咽管瘤OPN的蛋白表达量(96.29±12.83)低于成釉细胞型颅咽管瘤的表达量(174.83±50.80),t检验结果t’=-9.031,P=0.001,P<0.01,有统计学差异；在成釉细胞型颅咽管瘤中,各组颅咽管瘤OPN蛋白表达量差异均有显著性意义(P<0.05),无钙化组(115.66±14.620)<轻度钙化组(145.65±26.84)<中度钙化组(185.94±36.47)<重度钙化组(229.53±34.40)。RNA的表达情况检测结果与蛋白检测的结果一致。⑤CD44V6在成釉细胞型颅咽管瘤中表达最为明显,CD44V6阳性细胞围绕在钙化块周围,主要表达于成熟的肿瘤细胞,其表达强度随肿瘤细胞的成熟程度呈现明显的递增梯度；在鳞状细胞型颅咽管瘤也有表达CD44V6,也主要是在血管及其周围的细胞胞膜上。经Mann-Whitney U检验分析,CD44V6表达程度在成釉细胞型与鳞状细胞型之间差异具有统计学意义(Z=-4.775,P<0.001)。经Spearman秩相关分析,随着OPN表达的增加,CD44V6表达程度显著增强(rs=0.680,P<0.001)。⑥OPN免疫电镜显示成釉细胞型颅咽管瘤中金标记OPN颗粒的产生位于肿瘤细胞胞浆的内质网及高尔基体上,由内质网、高尔基体产生后分泌到胞外；而在鳞状细胞型颅咽管瘤细胞中未见金标OPN颗粒,少量可见颗粒仅见于肿瘤间质中的血管内皮细胞上。⑦蛋壳样钙化及大块钙化的颅咽管瘤存在骨化,而在鳞状细胞型颅咽管瘤、无钙化及砂粒样钙化的成釉细胞型颅咽管瘤标本中未见骨化的现象；骨化结构的分布与钙化的程度密切相关,骨化结构中可见大量细胞成分。钙化是颅咽管瘤骨化的基础；骨化使得没有生命的钙化块变成含有肿瘤细胞、间质细胞及钙化结构的复合体,成为术后残留钙化组织导致肿瘤复发的基础。⑧NF-κB(P65亚基)在成釉细胞型中过度表达,经Mann-Whitney U检验分析,成釉细胞型颅咽管瘤的表达显著高于鳞状细胞型颅咽管瘤(Z=-4.532,P<0.001)。经Spearman相关分析,在成釉细胞型中NF-κB(P65亚基)与OPN表达程度呈正相关。C反应蛋白在成釉细胞型颅咽管瘤患者肿瘤囊液、脑脊液及血清中明显升高,分别为(4.280±0.900)mg/mL、(0.035±0.006)mg/mL. (1.720±0.540)mg/mL。炎症是颅咽管瘤与周围重要结构紧密粘连主要的影响因素,颅咽管瘤炎症的发生与NF-κB信号通路激活密切相关。结论钙化是颅咽管瘤的主要特征,也是影响颅咽管瘤手术的主要困难。颅咽管瘤的钙化复杂而且分布广泛,是阻碍颅咽管瘤手术并导致术后并发症的重要因素。本研究中我们对OPN与颅咽管瘤钙化程度关系进行研究证实了颅咽管瘤钙化程度与OPN的表达密切相关；同时通过对OPN的受体CD44v6,这个只与活化了的OPN结合并且能够相互促进表达的受体,进行研究从另一个角度验证我们得到的OPN与钙化的关系的结果。为进一步确定颅咽管瘤细胞具有形成钙化的细胞基础,我们通过透射电镜观察肿瘤的超微结构,证实成釉细胞型颅咽管瘤具有内质网、高尔基体等细胞器具备了产生分泌蛋白的细胞基础,通过免疫电镜发现OPN主要是成釉细胞型颅咽管瘤的肿瘤细胞的内质网及高尔基体产生后分泌到肿瘤组织间质中的。而在鳞状细胞型颅咽管瘤中,瘤细胞内不表达OPN。两种类型颅咽管瘤在OPN表达的差异刚好与它们在肿瘤钙化发生的生物学差异相吻合,进一步证实OPN是其钙化的核心因子。颅咽管瘤细胞具有主动分泌OPN的特性,提示其钙化与生理性骨质形成具有相似之处,是主动的、可调节的过程。针对颅咽管瘤钙化中存在骨化及钙化切除不全导致术后肿瘤复发的现象,我们进一步对钙化的超微结构研究,发现颅咽管瘤骨化结构的出现与其钙化程度密切相关,骨化结构中含有大量的细胞成分。颅咽管瘤中骨化形成是在钙化形成后对于周围结构挤压、破坏造成的局部组织环境的改变,引起骨化相关的信号因子大量表达,使得间质中的纤维的分化及骨细胞的迁移所致；骨化与其钙化具有不同的形成机制,钙化是骨化形成的基础。这个实验结果说明颅咽管瘤中骨化结构的形成改变了原本没有生物活性的钙化结构,使其成为既有骨组织、钙化结构,又有肿瘤间质细胞及肿瘤细胞的复合体,这也很好的为我们解释了为什么颅咽管瘤钙化结构切除不完全也会导致肿瘤必然复发的现象。本实验发现在成釉细胞型颅咽管瘤中都存在大量坏死的细胞形成的湿性小节、纤维化、钙化、胆固醇沉积、肿瘤周围脑组织胶质增生等与炎症相关的特征性的变化；肿瘤组织及肿瘤间质中炎症细胞聚集,肿瘤组织中炎症相关因子明显增强,在患者血清、脑脊液及囊液中炎症相关的C反应蛋白明显升高,都说明了成釉细胞型颅咽管瘤存在严重的炎症反应。我们前期的研究也说明了成釉细胞型颅咽管瘤存在严重的炎症反应,这也是其与周围重要结构粘连紧密的主要原因,而在鳞状细胞型颅咽管瘤中并不存在这些现象。实验显示NF-κB的表达与OPN呈正相关,在成釉细胞型颅咽管瘤中NF-κB也呈过表达状态,证实在成釉细胞型颅咽管瘤中NF-κB信号通路的过度激活；同时也说明了钙化的程度也颅咽管瘤的炎症反应程度密切相关。虽然暂时不能确定是炎症促进了钙化的形成还是钙化导致了炎症的发生,但在本实验中我们发现颅咽管瘤的钙化及炎症反应均与OPN这个核心蛋白密切关联。总而言之,OPN是颅咽管瘤钙化形成的重要分子学基础,也是颅咽管瘤炎症反应、与周围结构粘连紧密等相关生物学特性的核心蛋白。