研究背景艰难梭菌(Clostridium difficile, C.difficile)是革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌,本身无侵袭性。当机体肠道内环境受到破坏时,部分产毒性艰难梭菌通过分泌毒素A、B以及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至伪膜性肠炎,统称为艰难梭菌感染(C.difficile infection, CDI)。据报道,随着艰难梭菌高毒力菌株(BI/NAP1/027型)的出现,艰难梭菌感染的发病率和死亡率均显著升高,引起全球的关注。艰难梭菌A、B毒素艰难梭菌可分为产毒株和不产毒株,不产毒株不引起临床症状。艰难梭菌产毒株主要分泌毒素A和毒素B,分别由tcdA和tcdB编码。毒素A又称肠毒素,容易使肠壁中性粒细胞浸润,释放淋巴因子,引起机体液体大量分泌和出血性坏死；毒素B又称细胞毒素,能使肌动蛋白解聚,损坏细胞骨架,导致细胞固缩坏死,直接损伤肠壁细胞。毒素B的毒力较毒素A强10倍。目前,已发现毒素A阴性、毒素B阳性的菌株；而毒素A阳性,毒素B阴性的菌株尚未被发现,表明毒素B可以单独致病。随着艰难梭菌感染的暴发性流行,艰难梭菌感染快速而敏感的实验室检测对于疾病感染的控制和临床诊治显得尤其重要。而选择tcdA和tcdB作为检测艰难梭菌的目的基因,能全面、特异的鉴定临床产毒株型艰难梭菌。目前,粪便中艰难梭菌检测的“金标准”是细胞毒素中和试验(C.difficile cytotoxin neutralization assay, CCNA)及艰难梭菌产毒培养(Toxigenic culture,TC),但因培养条件苛刻、技术要求高、操作复杂及耗时,难以用于临床艰难梭菌的常规检测。利用酶联免疫试验(Enzyme immunoassay, EIA)则特异、快速,不敏感；而乳胶凝集试验(Glutaimte dehydrogenase, GDH)则敏感、快速,但该方法存在交叉反应、假阳性率高,特异性差等缺点。国内外广泛应用的普通PCR则因实验仪器要求高、操作繁琐、耗时,扩增完成后,仍需要通过对产物进行电泳、显影等步骤判读结果,不适合各地基层医院及现场快速检测使用。因此,寻找快速、特异、敏感的艰难梭菌检测方法是艰难梭菌感染研究领域的新热点。艰难梭菌二元毒素在欧洲和北美洲引起广泛暴发流行的艰难梭菌高毒力菌株(BI/NAP1/027型)除分泌毒素A和毒素B外,还分泌毒力更强的二元毒素(C.difficile binary toxin, CDT)。CDT由致病性决定区外的2个染色体基因cdtA和cdtB编码。cdtA是一种ADP核糖转移酶,通过阻断肌动蛋白片段的合成,诱导机体细胞死亡。cdtB是一种运输蛋白,被丝氨酸蛋白酶激活后,cdtB通过与宿主细胞结合,把cdtA转移至细胞液中,诱导细胞骨架解聚,生成微管突出物,增强艰难梭菌的定植。因BI/NAP1/027型艰难梭菌的tcdC基因缺失18个碱基,产生的毒素A和毒素B分别是传统毒株的16倍和23倍,导致艰难梭菌感染病死率和耐药率均呈上升趋势。鉴于其暴发频率、危害性、国民的经济负担,迫切需要对艰难梭菌二元毒素进行有效的诊断和控制。目前,国际流行诊断艰难梭菌二元毒素的方法包括脉冲电场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)、限制性核酸内切酶分析(Restriction EndonucleaseAnalysis, REA)、核酸检测(普通PCR和多重实时PCR),尚无统一的诊断“金标准”。脉冲电场凝胶电泳(PFGE)不足之处：分型时间长、电泳条件复杂、需特殊的仪器和价格较高的试剂。限制性核酸内切酶分析(REA)不足之处为DNA图谱条带太多,难以分辨,容易污染。而国内最常用普通PCR和多重实时PCR检测艰难梭菌中的二元毒素,但因实验仪器要求高、操作繁琐、耗时,扩增完成后,仍需要通过对产物进行电泳、显影等步骤判读结果,不适合各地基层医院及现场快速检测使用。因此,快速、特异、敏感检测艰难梭菌中的二元毒素有助于及早筛选强毒力菌株,控制感染并指导临床诊疗。环介导恒温扩增技术环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),即针对靶基因6-8个特定区域设计4-6条特异引物,恒温(63-67℃)时,链置换DNA合成在BstDNA聚合酶的作用下,通过自我循环合成大量目的DNA并产生白色沉淀,从而实现对目的基因的快速检测。该方法检测时间短(30-60min),无需特殊仪器,操作简便,配合相应显色试剂还能实现肉眼判别结果。目前,LAMP方法已成功应用于细菌、病毒及寄生虫的定性和定量检测、胎儿性别鉴定等,已成为临床常用的快速检验方法。研究目的和意义本研究旨在建立一种在恒温条件下,快速、灵敏、特异、可视化、同步检测艰难梭菌A、B毒素基因或同步检测艰难梭菌二元毒素基因的方法,适用于基层医疗卫生单位及各疾病预防控制中心筛查和检测艰难梭菌及其高毒力菌株,为艰难梭菌的检测及毒素分型提供新的技术平台,有利于控制艰难梭菌感染的流行,指导临床诊疗。研究方法及内容研究对象：2013年8月1日-2014年1月31日期间,收集156例在南方医院住院及门诊腹泻患者的新鲜粪便标本(布里斯托分类5-7级),并检测标本艰难梭菌A、B毒素基因及二元毒素基因的携带情况。排除33例粪便标本(23例重复标本、10例粪便量太少或不满足新鲜粪便标本要求),剩余123例为适合本研究的粪便标本。研究方法及内容：1).环介导恒温扩增法快速检测艰难梭菌AB毒素基因。①引物的设计：通过BLAST软件分别针对艰难梭菌tcdA与tcdB重复序列进行同源性分析,获得其特异性保守序列,并将目标DNA分为6-8个独立区域,用软件Primer design V4针对该6-8个独立区域设计分别得到用于对艰难梭菌tcdA与tcdB进行LAMP检测的引物。②最佳引物筛查：通过对各组引物扩增效率的对比得出最佳引物组合。③最佳反应温度筛查：以艰难梭菌标准株VPI10463的DNA提取液作为模板,分别设置58℃-69℃ 12个温度梯度对最佳引物进行扩增,比较其扩增效率找出最佳反应温度。④敏感性实验：以艰难梭菌标准株VPI10463的DNA提取液作为模板,用去离子水进行10倍系列稀释,浓度从207 ng/μl到0.000207 pg/μl,分别用LAMP, PCR方法检测,比较两者敏感性。LAMP法同时使用实时浊度仪和钙黄绿色法判读结果。⑤特异性实验：用艰难梭菌标准株VPI10463作为阳性对照,去离子水作为阴性对照,分别用艰难梭菌tcdA与tcdB的最佳引物扩增26株常见致病菌,分别用LAMP, PCR方法检测。LAMP法同时使用实时浊度仪和钙黄绿色法判读结果。⑥粪便标本检测：对比LAMP法、PCR法和基因测序法检测123份粪便标本tcdA携带情况,以及对比LAMP法、PCR法和细胞毒素中和试验检测粪便标本中艰难梭菌B毒素的携带情况。2).环介导恒温扩增法快速检测艰难梭菌二元毒素基因。①引物的设计：通过BLAST软件分别针对艰难梭菌二元毒素基因cdtA与cdtB重复序列进行同源性分析,获得其特异性保守序列,并将目标DNA分为6-8个独立区域,用软件Primer designV4针对该6-8个独立区域设计分别得到用于对艰难梭菌cdtA与cdtB进行LAMP检测的引物。②最佳引物筛查：通过对各组引物扩增效率的对比得出最佳引物组合。③最佳反应温度筛查：以艰难梭菌027型临床分离株的DNA提取液作为模板,分别设置57℃-64℃ 8个温度梯度对艰难梭菌cdtA最佳引物进行扩增、设置57℃-68℃12个温度梯度对艰难梭菌cdtB最佳引物进行扩增,比较其扩增效率找出最佳反应温度。④敏感性实验：以艰难梭菌027型临床分离株的DNA提取液作为模板,用去离子水进行10倍系列稀释,浓度从24.8ng/μl到0.000248pg/μl,分别用LAMP,PCR方法检测,比较两者敏感性。LAMP法同时使用实时浊度仪和钙黄绿色法判读结果。⑤特异性实验：用艰难梭菌027型临床分离株作为阳性对照,去离子水作为阴性对照,分别用艰难梭菌二元毒素基因cdtA与cdtB的最佳引物扩增25株常见致病菌,分别用LAMP,PCR方法检测。LAMP法同时使用实时浊度仪和钙黄绿色法判读结果。⑥粪便标本检测：对比评价LAMP法和PCR法检测123份粪便标本艰难梭菌cdtA与cdtB的携带情况。研究过程结果1).LAMP去检测艰难梭菌毒素特异基因tcdA的最佳引物是A12,最佳反应条件是：61℃,反应60min。LAMP法检测艰难梭菌毒素特异基因tcdB的最佳引物是B0,最佳反应条件是：60℃,反应60min。同步检测tcdA及tcdB的最佳反应条件是：60℃,反应60min。LAMP法只扩增携带tcdA或tcdB基因的艰难梭菌,特异性良好。LAMP法对艰难梭菌毒素特异基因tcdA及tcdB的最低检出限均为20.7pg/μl,灵敏度为PCR法的10倍(PCR为207pg/μl)。基因测序法检测123例粪便标本,艰难梭菌tcdA的阳性率为29.3%(36/123),虽然LAMP法与PCR法的特异度无统计学差异,但是LAMP法的灵敏度、与基因测序的一致百分率均较PCR法高。“金标准”-细胞毒素中和试验检测123例粪便标本,艰难梭菌B毒素的阳性率为25.2%,而LAMP法与PCR法检测粪便标本艰难梭菌B毒素的灵敏度、特异度均无统计学差异。2).LAMP法检测艰难梭菌二元毒素cdtA基因的最佳引物是A2,最佳反应条件是：60℃恒温90min；检测cdtB的最佳引物是B4,最佳反应条件是：63℃恒温90min；同步检测cdtA和cdtB的最佳反应条件为：61℃恒温90min。LAMP法只扩增携带cdtA和cdtB基因的艰难梭菌,特异性良好。LAMP法对艰难梭菌毒素特异基因cdtA和cdtB的最低检出限均为24.8pg/μl,灵敏度为PCR法的10倍(PCR为248pg/μl)。LAMP法与PCR法检测粪便标本cdtA和cdtB时,两者检测结果完全一致。结论本研究已成功建立一种快速、特异、敏感、可视化、同步检测艰难梭菌A、B毒素基因或同步检测艰难梭菌二元毒素基因的方法,有望成为临床快速筛选艰难梭菌及其高毒力菌株的检测手段之一。