论文部分内容阅读
目的： 本课题组前期运用microRNA微阵列芯片检测了卵巢癌耐药组织及敏感组织中miRNA的差异表达谱，发现miRNA在卵巢癌耐药组织和敏感组织中表达具有差异性，进而在30例卵巢癌耐药组织和42例卵巢癌敏感组织中通过qRT-PCR的方法验证芯片中差异miRNA的表达，结果发现miR-200a-3p、miR-429、miR373-5p在卵巢癌耐药组织中下调表达，而miR-382-5p、miR-152、miR-299-5p、miR-381、miR-495和miR-410表达上调，经在卵巢癌耐药细胞系SKOV3-GFP/DDPⅡ(SKDDPⅡ)中验证发现miR-429、miR373-5p、miR-382-5p的结果与芯片表达一致。miR-429对卵巢癌耐药细胞的功能实验正在进行，而关于miR-373-5p、miR-382-5p与卵巢癌耐药的关系鲜有报道。miR-373-5p和miR-382-5p在卵巢癌耐药组织中的明显差异表达提示miR-373-5p、miR-382-5p的异常表达可能影响了卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，因此本研究旨在探讨miR-373-5p、 miR-382-5p对卵巢癌耐药细胞特性的影响。 若能提高miR-373-5p的表达水平或者沉默miR-382-5p的表达或可改善卵巢上皮癌细胞对化疗药物的敏感性，从而提高患者的预后。因此，我们首先通过体外实验验证miR-373-5p、miR-382-5p对卵巢癌耐药细胞系SKDDPⅡ细胞生物学功能的影响，以及体内实验验证miR-373-5p对卵巢上皮癌耐药的影响;并对miR-382-5p的靶基因及其结合位点进行验证;探讨miR-382-5p的预测靶基因MTAP的表达水平在评估患者对以铂类为基础的化疗反应及预后的关系，最后通过系统评价的方式来评价miRNA在临床应用于预测卵巢癌患者预后方面的价值。 方法： 1.miR-373-5p、 miR-382-5p对卵巢上皮癌耐药体内和体外生物学特性的影响 1.1我们首先通过CCK8法检测确定了所选用耐药细胞系SKDDPⅡ的耐药指数，通过荧光定量PCR检测对比miR-373-5p、miR-382-5p在敏感细胞系SKOV3-GFP(SKGFP)和耐药细胞系SKDDPⅡ中的表达情况。然后利用慢病毒表达载体成功构建稳定上调表达miR-373-5p和稳定下调表达miR-382-5p的SKDDPⅡ细胞模型，通过荧光定量PCR技术检测miR-373-5p、miR-382-5p的表达水平。 1.2 CCK8法检测转染后SKDDPⅡ细胞的IC50变化情况，Transwell试验检测细胞的迁移、侵袭能力，平板克隆形成实验检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期改变。 1.3扩大培养稳定转染miR-373-5p的SKDDPⅡ细胞注射于裸鼠腹股沟皮下，待肿瘤长至300-400mm3大小，给予顺铂2.5mg/kg腹腔注射，隔天给药，连续8次。观察肿瘤体积大小改变。 2.miR-382-5p靶基因的预测和鉴定 通过靶基因生物预测软件如miRBase、TargetScan等数据库预测miR-382-5p作用靶点，再通过Westem Blot技术检测转染后细胞的靶蛋白的表达量来验证软件预测靶基因。最后通过双荧光素酶报告系统验证靶基因与miRNA的具体结合位点。 3.miR-382-5p的潜在靶基因MTAP表达下调对卵巢癌耐药及预后的影响 我们对前一章软件预测到的miR-382-5p的靶基因，通过生物软件Kaplan-Meier plotter(KM plotter)分析与卵巢癌患者预后的关系，最后得到MTAP基因，并用KM plotter软件绘制生存曲线验证MTAP对卵巢癌的预后价值，接着检测了MTAP在卵巢癌耐药细胞系和组织中的表达情况。然后我们通过检索TCGA数据库，提取MTAP在90例卵巢癌耐药组织和197例卵巢癌敏感组织中表达数据，比较MTAP的表达情况。最后，我们通过生物信息学分析了MTAP与卵巢癌耐药之间的关系。 4.miRNA作为卵巢癌预后标志物的meta分析 通过计算机检索Pubmed、Embase英文数据库关于miRNA与卵巢癌预后相关的文章。各数据库均从建库直至2016年12月。患者的总生存期、无进展生存期及无病生存期的风险比(HR)及关联95％可信区间(95％CI)被用来计算合并效应量。采用stata11.0软件进行meta分析。 结果： 1.miR-373-5p、miR-382-5p对卵巢上皮癌耐药体内和体外生物学特性的影响 1.1与亲本细胞SKGFP相比，耐药细胞系SKDDPⅡ对化疗药物顺铂的耐药指数为2.35，符合耐药细胞系的要求。荧光定量PCR检测发现miR-373-5p、miR-382-5p在耐药细胞系中的表达分别下调表达0.786倍、上调表达3.979倍(p＜0.05）。 1.2在SKDDPⅡ中转染了LV-miR-373-5p过表达病毒及LV-anti-miR-382-5p沉默病毒，miR-373-5p的表达量较SKDDPⅡ及SKDDPⅡ/miR-NC组，明显升高(p＜0.05），miR-382-5p的表达量较SKDDPⅡ及SKDDPⅡ/miR-NC组，明显降低(p＜0.05）。 1.3过表达miR-373-5p或沉默miR-382-5p后，SKDDPⅡ对顺铂的IC50明显下降(p＜0.01，p＜0.05)。 1.4 Transwell迁移、侵袭结果:过表达miR-373-5p或沉默miR-382-5p后的SKDDPⅡ细胞组的穿膜细胞数较对照组明显减少，差别有统计学意义(p＜0.01) 1.5平板克隆实验结果:过表达miR-373-5p或沉默miR-382-5p后的SKDDPⅡ细胞组的集落形成数在无药物作用下较对照组无明显差异，p＞0.05;在0.4μg/ml的顺铂作用下，其克隆形成率明显下降(p＜0.01，p＜0.05)。 1.6 FCM检测细胞凋亡实验结果:过表达miR-373-5p或沉默miR-382-5p后的SKDDPⅡ细胞组的凋亡率在顺铂药物作用下较其对照组细胞明显升高(p＜0.05），而在无药物作用下，各组细胞的凋亡率差异无统计学意义，p＞0.05。 1.7 FCM检测细胞周期实验结果:过表达miR-373-5p或沉默miR-382-5p后的SKDDPⅡ细胞组在顺铂药物作用下较其对照组细胞出现了明显的G0/G1阻滞(p＜0.05），并伴随增殖期S期细胞的显著减少;而在无药物作用条件下，各组细胞G0/G1阻滞差异无统计学意义，p＞0.05。 1.8裸鼠移植瘤实验结果:过表达miR-373-5p组的裸鼠移植瘤的生长速度较对照组无明显差异，在给予顺铂处理后，肿瘤体积大小与对照组亦无明显差异，p＞0.05。 2.miR-373-5p、 miR-382-5p靶基因的预测和鉴定 2.1miR-382-5p的作用靶点的预测及验证:经过检索数据库，选择评分较高的HIPK3、PTEN为miR-382-5p的候选靶基因。 2.2 Western Blot检测发现沉默miR-382-5p表达组中PTEN、HIPK3蛋白的表达量较对照组降低(p＜0.05)。 2.3荧光素酶报告系统显示HIPK3与miR-382-5p存在结合位点，而PTEN与miR-382-5p存在结合位点的可能性较低。 3.miR-382-5p的潜在靶基因MTAP表达下调对卵巢癌耐药及预后的影响 3.1通过生物软件KM plotter分析miR-382-5p的预测靶基因提示，MTAP、PTEN与卵巢癌的不良预后密切相关，因PTEN与卵巢癌耐药关系较明确，因此仅对MTAP做了如下研究，在卵巢癌中MTAP的低表达预示着患者缩短的无进展生存期(p=0.027)和总生存期(p=0.0033)。 3.2与亲本卵巢癌细胞系A2780、SKOV3相比，MTAP在卵巢癌耐药细胞系中表达降低:A2780/DDP(p=0.021)，A2780/CBP(p=0.002)和SKOV3/DDP(p=0.008)。 3.3 MTAP在卵巢癌耐药组织中的表达水平也较敏感组织降低(p=0.003)。运行从TCGA提取的数据，MTAP在铂类耐药组织中的表达较敏感组织也是降低的(p=0.024)。 3.4生物信息学分析显示MTAP和卵巢癌铂类耐药关系密切。 4.miRNA作为卵巢癌预后标志物的meta分析 共纳入20篇文献，共2045例患者，miRNA的低表达与卵巢癌患者总生存期(HR=2.232，95％ CI:1.607-3.100，p＜0.001)缩短相关，并且miRNA低表达的卵巢癌患者的无病生存期(HR=1.94，95％ CI:1.30-2.91，p＜0.001)也降低，但miRNA的低表达与患者无进展生存期(HR=1.02，95％ CI:0.45-2.32，p＞0.05)无明确相关关系。 结论： 1.在SKDDPⅡ细胞中过表达miR-373-5p或沉默miR-382-5p后，细胞阻滞于G0/G1期，增加细胞在顺铂作用下的凋亡，增强细胞对顺铂的敏感性;并可降低耐药细胞的迁移、侵袭能力。 2.miR-382-5p可通过调控HIPK3而发挥其化疗增敏作用，沉默miR-382-5p对PTEN基因的表达有抑制作用，而双荧光素酶验证结果为阴性，说明miR-382-5p间接作用于PTEN而发挥其化疗增敏作用。 3.miR-382-5p的预测靶基因MTAP的低表达可以预测卵巢癌患者的不良预后和对铂类为基础的化疗反应，有望成为潜在的预测卵巢癌患者对以铂类为基础的化疗反应及预后的生物标志物。 4.经meta分析结果提示，miRNA的低表达与卵巢癌患者的不良预后密切相关，并且miRNA的预测靶基因多富集于调节卵巢癌耐药的通路中，miRNA有望成为临床上卵巢癌预后评估的一种新型标志物，对卵巢癌临床治疗方案的选择提供一定的指导意义。