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病毒感染细胞,细胞开启主动的程序性死亡模式阻止病毒的复制传播。但是同时病毒也进化出多种生存策略(比如抗细胞凋亡)来抵御细胞凋亡使之与宿主细胞共存。研究抗细胞凋亡一般需要在建立细胞凋亡模型的基础上进行,目前使用物理刺激如紫外线(Ultraviolet,UV),药物如双氧水(Hydrogenperoxide,H2O2)、丝裂霉素C,细胞因子(如Fas、TNFα)等诱导细胞凋亡,已较为成熟。以400μmol/L双氧水处理鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast,DEF)12h,经DAPI染核、荧光定量RT-PCR检测凋亡因子半胱天冬酶3(caspase3)和半胱天冬酶9(caspase9)转录水平、半胱天冬酶活性检测试剂盒检测caspase3/7和caspase 9蛋白裂解水平,结果显示,H202处理后DEF细胞核缩小、变形呈烂泥状,且出现凋亡小体,caspase 3、caspae9的mRNA水平与蛋白裂解水平均上调(p*<0.05;n=3),证明H2O2引起了 DEF细胞凋亡,且凋亡与线粒体通路有关。本实验利用双氧水首次在鸭胚成纤维细胞上构建细胞凋亡模型,为抗细胞凋亡功能基因的研究奠定基础。单纯疱疹病毒一型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)的多个基因产物已证明具有抗细胞凋亡功能,其中包括HSV-1US5基因。但是与HSV-1同属于疱疹病毒甲亚科的鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)还未见有抗细胞凋亡功能相关基因的报道。因此,本实验在构建双氧水凋亡模型的基础上检测与HSV-1 US5基因同源的DPV US5基因能否抑制其引起的细胞凋亡。首先,构建鸭瘟病毒US5基因真核表达质粒pCAGGS-US5,PCR、双酶切鉴定及测序结果表明pCAGGS-US5正确。用实验室已有的US5基因原核表达重组质粒pET-32a(+)/US5(M)转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达,尿素洗涤得到纯化的gJ蛋白用于免疫白兔,得到兔抗DPV-gJ多克隆抗体。将重组真核表达质粒pCAGGS-US5转染DEF细胞,用制备的兔抗DPV-gJ多克隆抗体检测US5基因在DEF细胞中的表达,并在构建好的凋亡模型基础上,运用caspase活性检测试剂盒检测表达gJ蛋白和未表达gJ蛋白的DEF细胞的caspase 3/7蛋白活性变化,结果显示pCAGGS-US5表达产物抑制caspase 3/7蛋白裂解(p*<0.05;n=3),进而抑制H202引起的DEF细胞凋亡。