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目的:本课题应用光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)对小鼠肝癌移植瘤进行实验性治疗。观察PDT对荷瘤小鼠肿瘤生长和生存期的影响，以及PDT对荷瘤小鼠全身和肿瘤局部免疫效应的影响，探讨光动力学疗法的免疫效应机理，为肝癌的临床治疗提供实验依据；观察PDT与卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG)局部免疫治疗联合应用后对肿瘤生长和免疫效应的影响，探讨联合治疗的可行性及有效性，为肝癌的临床综合治疗提供新的途径和新的思路。
方法:建立小鼠Heps肝癌移植瘤模型96只，待移植瘤的长径达到0.8～1.2cm时，随机分为荷瘤对照组、PDT组、免疫治疗组和光动力免疫治疗(photodynamicimmunotherapy，PDIT)组，每组均24只小鼠。PDT组每只小鼠尾静脉注入光敏剂PSD-007 20 mg/kg体重，7小时后照射肿瘤局部。光斑直径2cm，功率密度为190～200 mW/cm<2>，能量密度为170～180 J/cm<2>。免疫治疗组的荷瘤小鼠肿瘤局部注射BCG 1×10<7>CFU。光动力免疫治疗组于PDT后即时在荷瘤小鼠的肿瘤局部注射BCG1×10<7>CFU。1.待瘤结节长出后隔日观测四组荷瘤小鼠的肿瘤大小，计算肿瘤体积和治疗后14天的抑瘤率；2.记录接种当天开始至荷瘤小鼠死亡的时间。荷瘤小鼠全部于接种后90天处死，计算四组荷瘤小鼠90天生存率。3.四组分别于治疗后2小时、24小时以及7天分批处死6只荷瘤小鼠，瘤组织取材，常规病理组织学切片，HE染色，光学显微镜观察。4.四组荷瘤小鼠分别于治疗后2小时、24小时尾静脉采血并涂片，测定其外周血白细胞计数和白细胞分类计数；5.取四组荷瘤小鼠治疗后2小时、24小时以及7天的瘤组织切片，F4/80抗体免疫组织化学染色计数肿瘤局部组织的巨噬细胞(macrophages，MФ)数量；6.取四组荷瘤小鼠上述时间点的瘤组织切片，甲苯胺兰染色计数肿瘤局部组织的肥大细胞(mast cell，MC)数量；7.取四组荷瘤小鼠上述时间点的血清，双抗体夹心法酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测荷瘤小鼠外周血中的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和白细胞介素(interleukin，IL)-1β的分泌水平。
结果
1.PDT组、PDIT组以及免疫治疗组治疗后7天以及14天的移植瘤的体积较荷瘤对照组均明显缩小(P<0.01)。PDT组、PDIT组治疗后7天以及14天的肿瘤体积较免疫治疗组均明显缩小(P<0.01)。PDIT组治疗后7天的肿瘤体积较单纯PDT组明显缩小(P<0.05)。PDT组、免疫治疗组和PDIT组治疗后14天的抑瘤率分别为97.95％、21.48％、98.26％。
2.PDT组荷瘤小鼠的90天生存率(83.33％)和PDIT组荷瘤小鼠的90天生存率(100％)明显高于荷瘤对照组(0)，P<0.05。PDIT组荷瘤小鼠的90天生存率明显高于单纯免疫治疗组(33.33％)，P<0.05。而PDT组和PDIT组、PDT与免疫治疗组、免疫治疗组与荷瘤对照组的生存率之间差异无统计学意义，P>0.05。
3.HE 染色结果显示，荷瘤对照组肿瘤细胞分布密集，肿瘤组织内瘤细胞坏死、液化少见，肿瘤间质无纤维组织增生，肿瘤内仅见少量免疫细胞浸润。PDT组治疗后2小时可见肿瘤细胞退变明显，核固缩空泡变性，其中大量中性粒细胞浸润；PDT后24小时可见大片肿瘤细胞坏死，胞膜破裂、崩解，核碎裂、游离或溶解，肿瘤细胞结构不清；PDT后7天可见到大片呈凝固性坏死改变的肿瘤细胞，细胞形态消失，被均匀粉染的无结构物质取代。坏死区外缘均可见大量中性粒细胞和巨噬细胞浸润，坏死细胞间可见纤维结缔组织增生，其中有不同程度的巨噬细胞浸润。单纯免疫治疗组治疗后2小时，肿瘤细胞坏死不明显，间质中大量炎性细胞浸润。治疗后24小时，肿瘤组织坏死呈灶样分布，间质中大量炎性细胞浸润。治疗后7天，肿瘤组织坏死无明显变化，间质中大量炎性细胞浸润。PDIT组治疗后可见肿瘤组织坏死明显，较单纯PDT组坏死面积更大，伴有大量中性粒细胞和巨噬细胞浸润。
4.荷瘤小鼠外周血白细胞总数和分类测定结果显示，治疗后2小时，PDT组的荷瘤小鼠外周血中性粒细胞数量为(8.92±1.03)×10<9>/L，PDIT组的荷瘤小鼠外周血中性粒细胞数量为(9.26±1.22)×10<9>/L，均明显高于荷瘤对照组的(4.07±0.55)×10<9>/L和单纯免疫治疗组的(4.19±0.69)×10<9>/L，P<0.01。治疗后24小时，PDT组的荷瘤小鼠外周血中性粒细胞数量为(18.24±3.55)×10<9>/L，PDIT组的荷瘤小鼠外周血中性粒细胞数量为(19.58±4.13)×10<9>/L，均明显高于荷瘤对照组的(4.07±0.55)×10<9>/L和单纯免疫治疗组的(3.97±0.58)×10<9>/L，P<0.01。
5.免疫组化染色结果显示，PDT组和PDIT组治疗后2小时、24小时以及7天肿瘤局部巨噬细胞数量，均明显高于荷瘤对照组和单纯免疫治疗组(P<0.01)。PDIT组上述时间点肿瘤局部巨噬细胞数量，明显高于单纯PDT组(P<0.05)。单纯免疫治疗组治疗后24小时和治疗后7天肿瘤局部巨噬细胞数量，明显高于荷瘤对照组(P<0.01)。
6.甲苯胺兰染色结果显示，PDT组和PDIT组治疗后24小时和7天的肿瘤局部肥大细胞数量，均明显高于荷瘤对照组和单纯免疫治疗组(P<0.01)。PDIT组治疗后2小时和治疗后7天的肿瘤局部肥大细胞数量，均明显高于单纯PDT组(P<0.01)。
7.ELISA结果显示，PDT组和PDIT组治疗后2小时、24小时以及7天血清中细胞因子IL-1β和TNF-α的水平，均明显高于荷瘤对照组和单纯免疫治疗组(P<0.01)。PDIT组治疗后24小时和7天血清中细胞因子IL-1β和TNF-α的水平，均明显高于单纯PDT组(P<0.05)。免疫治疗组治疗后2小时、24小时以及7天血清中细胞因子IL-1β和TNF-α的水平，均明显高于荷瘤对照组(P<0.01)。
结论
1.PDT可使肝癌细胞变性、坏死，肿瘤体积缩小，达到杀灭原发灶的目的，并明显提高荷瘤小鼠的生存率。
2．PDT后荷瘤小鼠肿瘤局部巨噬细胞和肥大细胞浸润均明显增加，外周血中性粒细胞数量迅速增高，血清中细胞因子IL-1β和TNF-α的水平明显增高。提示PDT可增强荷瘤宿主全身和肿瘤局部的免疫力。
3．PDT联合局部注射卡介苗的治疗方法可明显抑制小鼠肝癌的生长，提高荷瘤小鼠的生存率。联合治疗后肿瘤局部巨噬细胞和肥大细胞数量，均明显高于单纯PDT组。提示PDIT可增强荷瘤小鼠免疫力，疗效优于单用PDT，为肝癌临床的综合、个体化治疗提供有力的证据。