论文部分内容阅读
研究背景和研究目的:肝细胞癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率较高,且预计将在2030年占据全球癌症死亡原因的第三位,这对我国人民的生命安全构成严重的威胁。尽管目前存在多种诊断与治疗肝癌的方法,但由于肝癌发病机制仍未完全明确,因此临床上缺乏有效的针对不同阶段肝癌患者的治疗方法。除此之外,肝癌本身还具有侵袭性强、增殖速度快、复发率高等恶性特点,这是肿瘤微环境和发病机制的复杂性与耐药性现象频发共同造成的。其中,肝癌干细胞是导致肝癌快速进展和高复发率的重要因素之一。肝癌干细胞（LCSCs）是一类具有自我更新和无限增殖能力的肿瘤细胞。这类细胞来源丰富、分布广泛,并表现出成瘤性强和多药耐药的恶性特征,因此成为肿瘤发生、发展和治疗失败的重要原因之一。由于其来源广泛且增殖能力强等特点,近年来肝癌干细胞成为肿瘤研究领域的一个热点。微小RNA（miRNA）参与了肝细胞癌的发生、进展、复发和耐药。miR-4461是一种线粒体相关的miRNA,是一种新发现的miRNA,其在多种生物过程和发病机制中的功能仍未完全阐明。先前的研究发现,miR-4461通过靶向PPP1R3C抑制肾细胞癌的肿瘤发生。Chen及其同事发现miR-4461通过下调结直肠癌中COPB2表达来抑制肿瘤发生。然而,miR-4461在肝癌干细胞中的功能尚不清楚。相对于其他细胞,肝癌干细胞的另一个重要特性是多药耐药性。考虑到许多miRNA可以调控癌症耐药,例如miR-122通过促进细胞凋亡从而赋予耐药的肝癌细胞索拉非尼敏感性,而miR-221则具有相反的作用,在体内通过抑制caspase-3介导的细胞凋亡来增强耐药性。因此,我们考虑miR-4461是否也可以调控肝癌的耐药性。在本课题中,我们的研究目的是探讨miR-4461在肝癌干细胞中以及耐药中的作用,并探讨其在临床应用上的意义。研究方法:第一部分一、miR-4461在肝癌干细胞中的表达情况。通过Realtime PCR检测肝癌病灶来源的原代肝癌干细胞和人肝癌细胞系来源的肝癌干细胞中miR-4461的表达情况,并检测肝癌干细胞分化过程中miR-4461表达的变化情况。二、miR-4461调控肝癌干细胞自我更新能力和致瘤性的恶性表型。本研究构建了miR-4461过表达和敲低的肝癌细胞系,并使用低粘附成球实验、流式分析和Real-time PCR检测了肝癌干性相关分子Ep CAM和CD24的表达。同时采用Real-time PCR和Western Blot检测了肝癌干细胞相关转录因子SOX2和OCT4的表达,以确认miR-4461对肝癌干细胞自我更新能力的影响。此外,通过体内外有限稀释实验和荷瘤组织的组织化学染色,探究了miR-4461对肝癌干细胞成瘤能力的影响。三、miR-4461调控肝癌干细胞自我更新能力和致瘤性的机制探索。首先,通过生物信息学分析确定miR-4461可能结合到SIRT1上。随后,利用Real-time PCR和Western Blot检测发现,在miR-4461敲低时,肝癌细胞中SIRT1的表达量增高,进一步的双荧光素酶报告实验验证了miR-4461直接靶向SIRT1的作用。值得一提的是,在人源肿瘤细胞系异种移植形成的小鼠皮下荷瘤和临床收集的肝癌样本中,miR-4461和SIRT1的表达量呈负相关性,从而进一步证实了miR-4461和SIRT1的结合作用。最后,在miR-4461敲低的肝癌细胞和对照细胞中转染SIRT1的si RNA,利用成球实验和体内外有限稀释实验证明miR-4461是通过影响SIRT1抑制肝癌干细胞的自我更新能力和致瘤性。第二部分一、检测耐药肝癌组织中miR-4461的表达水平并初步探索其与肝癌耐药的相关性。二、构建miR-4461过表达的细胞系,并通过测定顺铂IC50、平板克隆和细胞凋亡等实验,检测miR-4461过表达是否可以影响顺铂诱导的肝癌细胞凋亡。三、利用HCC-PDX模型,比较miR-4461表达高低对肝癌模型对顺铂反应性的影响。第三部分一、miR-4461与病人手术后预后的相关性。为了探索miR-4461与病人手术后预后的相关性,利用Kaplan-Meier分析评估肝癌病例中miR-4461水平与病人手术后预后的关系,以确定miR-4461是否可作为临床上预测肝癌手术预后的生物标志物。二、miR-4461与手术后接受TACE治疗病人预后的相关性。收集临床样本,采用Kaplan-Meier方法评估miR-4461对手术后接受TACE治疗病人预后的指导价值。实验结果:第一部分我们在这里表明,miR-4461在肝癌干细胞中的表达降低,其表达和肝癌干细胞的分化密切相关;同时,miR-4461在复发性、转移性肝癌组织中低表达。敲低miR-4461可增强肝癌干细胞的自我更新能力和致瘤性。反之,miR-4461过表达则可以抑制肝脏肿瘤干细胞的自我更新能力和肿瘤发生。在机制上,miR-4461通过直接靶向sirtuin 1（SIRT1）实现调控肝癌干细胞的功能。第二部分耐药性肝癌组织中miR-4461的表达被抑制,表明miR-4461的表达水平与肝癌耐药性有关。在肝癌细胞中过表达miR-4461时,肝癌细胞对顺铂治疗的敏感性增强。在PDXs实验中,高miR-4461表达的人类肝癌移植瘤对顺铂治疗表现出更高的敏感性。第三部分经Kaplan-Meier分析发现,miR-4461的低表达可以预测肝癌患者手术后的不良预后;此外,通过收集临床队列并进行分析发现,高miR-4461的肝癌患者在术后再接受经导管动脉化疗栓塞（TACE）治疗后获益更多。结论:总的来说,我们的研究结果揭示了miR-4461在抑制肝癌干细胞的恶性特征方面扮演着重要角色。这表明miR-4461有可能成为预防和干预肝癌的下一个有效靶标。另外,miR-4461对手术预后和TACE治疗效果的预测作用,使其在肝癌治疗方式选择方面具有较好的临床意义。