目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的常见并发症,是引起终末期肾衰的主要原因之一。DN的发病机制非常复杂,糖脂代谢紊乱、肾脏血流动力学改变、多种细胞因子及遗传背景均起重要作用。近年来,在探索DN病因时,有人提出了炎症发病学说,认为DN是一种自然免疫和低度炎症疾病,炎症能引起DN,并在DN进展的整个过程中起重要作用。高糖、血液动力学障碍等均可损伤肾脏固有细胞,细胞损伤后释放前炎症介质,导致白细胞滤出到损伤部位并活化。局部浸润的炎细胞及肾脏固有细胞均可产生炎症因子,参与DN的发生发展,然而有关炎症因子在糖尿病肾损伤中的作用机制研究甚少。DN的病理变化复杂,早期主要表现为肾小球和肾小管的肥大,晚期则出现肾小球硬化及肾小管间质纤维化。肾小管间质纤维化是各种不同病因的慢性肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭时的共同病理变化。且肾小管间质纤维化的程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切,是慢性肾病进展至终末期肾衰的特征。其中肌成纤维细胞的出现在肾小管间质纤维化发生发展过程中至关重要。α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin a-SMA)阳性的肌成纤维细胞是一种具有平滑肌细胞特性的成纤维细胞,是肾间质中细胞外基质的主要来源。正常肾组织中几乎无肌成纤维细胞,但在多种病理状态下,肾组织中可出现较多肌成纤维细胞。肌成纤维细胞可来源于成纤维细胞的分化,血管外周细胞的迁移,也可来自于肾小管上皮细胞。其中小管上皮细胞通过表型转分化转变为肌成纤维细胞越来越引起人们的关注。多种因素可诱导小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞,如血管活性物质、细胞外基质等。此外,肾小管上皮细胞转分化常与肾间质炎症反应同时出现,考虑这种微环境的改变可能与小管上皮细胞转分化有关。因此探讨DN肾间质中炎细胞浸润、炎症因子的产生及其作用机制,可为DN的抗炎治疗提供理论依据。白介素-1(interleukin-1,IL-1)是非常重要的炎症介质,其中IL-1β可抑制人近端小管上皮细胞增生、诱导肾小管上皮细胞损伤并促使其表达α-SMA,上调纤维粘连蛋白的合成,从而促进肾小管间质纤维化。抑瘤素M (OncostatinM OSM)是继IL-6、TNF、白血病抑制因子等后发现的一种具有重要生物学意义的细胞因子,可参与炎症反应等。最近体外研究表明OSM可诱导肾小管上皮细胞转分化；可见IL-1β和OSM均可参与肾小管间质纤维化的发生发展,但有关二者在DN肾组织中的表达及其作用的研究鲜见报道。细胞因子信号抑制因子(suppressors of cytokine sigmaling, SOCS)家族是近年来发现的一类可反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负性调节因子,可被多种细胞因子快速诱导,从而构成负反馈调节回路。SOCS-1和SOCS-3在体内分布较为广泛。先前的研究已经证实,SOCS-1、SOCS-3蛋白均参与DN的发病过程。但有关SOCS-1、SOCS-3与DN炎症状态及小管上皮细胞转分化之间相互关系的研究未见报道。因此,本研究应用糖尿病小鼠模型和体外培养的人肾近曲小管上皮细胞(HKC),从整体、细胞和分子等不同水平,系统观察糖尿病肾病早期肾组织中单核巨噬细胞浸润及炎症因子IL-1β、OSM的表达情况,及在IL-1β或OSM刺激下肾小管上皮细胞转分化的情况,从而探讨炎症在糖尿病肾病肾小管间质纤维化发病机制中的作用；此外我们应用体内外质粒转染技术,观察SOCS-1、SOCS-3过表达时糖尿病小鼠肾组织炎症状态及SOCS-1、SOCS-3过表达对IL-1β或OSM刺激的HKC转分化的影响,进一步探讨SOCS-1、SOCS-3基因在DN炎症发病机制中的作用,以期为进一步阐明糖尿病肾病发病的分子机制及其防治提供一条新的思路。方法：1小鼠糖尿病模型的制备及肾组织中角蛋白18(cytokeratin 18 CK18)、α-SMA、SOCS-1、SOCS-3、p-STAT1、CD68、IL-1β和OSM的检测雄性CD-1小鼠行右肾切除术,伤口愈合后将实验动物随机分为两组：对照组(N)和糖尿病组(DM)。模型组小鼠腹腔单次注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ,溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,pH值4.5,150mg/kg),对照组只注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,72h后测定血糖和尿糖,血糖值≥16.7mmol/L,尿糖值+++-++++者确定为糖尿病模型成功。分别于成模后4、8、12周每组取6只小鼠；收集血尿,进行血尿生化指标测定；切取肾脏进行以下处理及观察：取部分肾皮质组织置于4%多聚甲醛或4%戊二醛固定用于光镜观察及免疫组织化学染色；部分肾皮质组织经液氮速冻后保存于-80℃冰箱,用于提取蛋白及RNA；另取部分肾皮质组织于70%酒精固定,用于流式细胞术检测。应用免疫组织化学、Western blot以及RT-PCR方法检测糖尿病小鼠肾组织中角蛋白18(cytokeratin 18 CK18)、α-SMA.SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的表达；应用Western blot检测p-STAT1蛋白的表达；应用流式细胞术检测肾组织中巨噬细胞的标志蛋白CD68的表达；应用ELISA检测肾皮质组织中IL-1β和OSM蛋白的表达。2 HKC培养及CK18、α-SMA、SOCS-1、SOCS-3、p-STAT1及Ⅰ型胶原(collagenⅠColⅠ)和纤维连接蛋白(fibronectin FN)的检测体外培养HKC,用含10%胎牛血清及100KU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基培养,刺激前先用无血清DMEM培养基同步培养24h,之后将细胞分成5组：对照组(N)；IL-1β(10ng/ml)刺激组(IL)；IL-1β+AG490(10μmol/L)组(IL+A)；OSM(10ng/ml)刺激组(OSM)；OSM+AG490(10μmol/L)组(O+A)。培养72h收集细胞,2.5%戊二醛固定后用于电镜观察细胞超微结构改变；培养24、48、72h分别收集细胞及其上清液,提取细胞总蛋白、RNA,采用免疫细胞化学、Western blot和RT-PCR检测CK18、α-SMA及SOCS-1、SOCS-3蛋白和mRNA的表达；采用Western blot检测p-STAT1蛋白的表达；采用ELISA检测上清液中Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的分泌水平。3体外SOCS-1、SOCS-3基因转染及CK18、α-SMA、SOCS-1、SOCS-3、p-STAT1、ColⅠ和FN的检测应用lipofectamine 2000转染试剂将PCR3.1-SOCS-1、PCR3.1-SOCS-3真核表达载体转染入HKC,经G418(0.5mg/ml)筛选,建立HKC SOCS-1、SOCS-3基因转染稳定细胞系,细胞分成9组：对照组(N)；IL-1β(10ng/ml)组(IL)；IL-1β+PCR3.1-SOCS-1转染组(IL+PS1)；IL-1β+PCR3.1-SOCS-3转染组(IL+PS3)；IL-1β+PCR3.1-Vector空质粒转染组(IL+PV);OSM (10ng/ml)组(OSM);OSM+PCR3.1-SOCS-1转染组(OSM+PS1);OSM+PCR3.1-SOCS-3转染组(OSM+PS3);OSM+PCR3.1-Vector空质粒转染组(OSM+PV)。分别于24h、48h、72h收集细胞,免疫细胞化学、Western blot和RT-PCR检测细胞SOCS-1、SOCS-3、CK18、α-SMA蛋白及mRNA的表达；Western blot检测p-STAT1蛋白的表达；ELISA检测细胞上清中ColⅠ和FN蛋白的表达。4体内转染SOCS-1、SOCS-3基因及CK18、α-SMA、SOCS-1、SOCS-3、p-STAT1、CD68、IL-1β和OSM检测雄性CD-1小鼠行右肾切除术,伤口愈合后将实验动物随机分为5组：.对照组(N)；糖尿病组(DM); PCR3.1-Vector空质粒组(DM+V)；PCR3.1-SOCS-1质粒组(DM+S1);PCR3.1-SOCS-3质粒组(DM+S3)。模型制备同前。质粒注射组小鼠在成模后8周分别给予尾静脉快速注射pEF-FLAG-I/mSOCS-1质粒(1mg/kg)或pEF-FLAG-I/mSOCS-3 (1 mg/kg);空质粒组用同种剂量和方法注射pEF-FLAG-I空质粒。此后每隔7天注射一次。成模后16周每组取6只小鼠,收集血尿,进行血尿生化指标测定；切取肾脏进行以下处理及观察：具体操作同方法1结果：1糖尿病小鼠肾小管上皮细胞转分化与肾组织炎症反应情况①光镜下观察,糖尿病组与对照组小鼠肾组织相比肾小球体积增大,系膜基质轻度增多,部分肾小管上皮细胞出现空泡变性。②免疫组化结果显示,CK18主要定位于肾小管上皮细胞胞浆内,对照组肾组织中α-SMA蛋白仅定位于血管平滑肌细胞浆内,呈强阳性。与对照组相比,糖尿病组小鼠肾小管上皮细胞CK18蛋白及mRNA的表达逐渐减少并出现逐渐增强的α-SMA蛋白及mRNA的表达。③SOCS-1、SOCS-3蛋白在对照组肾组织中仅见少量表达,主要表达于肾小管上皮细胞胞浆。与对照组相比,糖尿病组SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的表达增强,在糖尿病4周时表达最强,之后逐渐下降,但仍高于对照组。④与对照组相比,糖尿病组p-STAT1的表达水平增高,4周时表达最强,之后逐渐下降,12周时与正常对照组无明显差异。⑤流式细胞术检测结果显示,CD68(巨噬细胞标志蛋白)在糖尿病小鼠肾组织的表达明显高于对照组；ELISA结果显示,糖尿病小鼠肾组织中IL-1β和OSM的表达明显高于对照组。2细胞因子IL-1β或OSM对HKC中SOCS-1、SOCS-3表达及细胞表型转分化影响①透射电镜观察,与对照组相比,IL-1β或OSM刺激后HKC内质网轻度扩张,线粒体明显减少,部分嵴消失,刺激72h后,HKC内出现肌动蛋白丝。②SOCS-1、SOCS-3蛋白主要在HKC胞浆表达,与对照组比较,IL-1β及OSM刺激组SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的表达均增多,刺激24h表达最强,之后逐渐下降,但仍高于对照组。AG490可部分抑制二者蛋白及mRNA的表达。③在IL-1β或OSM刺激下,CK18蛋白及mRNA的表达逐渐减少,而α-SMA蛋白和mRNA的表达逐渐增强。细胞因子刺激的同时加入AG490能部分逆转二者的改变。④IL-1β和OSM均可激活STAT1,使p-STAT1水平上升,加入AG490干预可明显抑制p-STAT1的表达。⑤ELISA结果显示,与对照组相比,IL-1β和OSM组细胞上清液中ColⅠ和FN的分泌逐渐增多,而AG490干预可明显抑制其分泌。3 SOCS-1、SOCS-3基因转染及二者对IL-1β或OSM刺激HKC表型转分化的影响①提取的PCR3.1-SOCS-1、PCR3.1-SOCS-3质粒经0.8%琼脂糖凝胶电泳,结果显示和标准质粒电泳图谱条带相符。②SOCS-1、SOCS-3转染组其各自的蛋白和mRNA的表达量明显高于对照组和空载体转染组,表明SOCS-1、SOCS-3基因成功导入HKC,并在蛋白水平获得高效表达。③免疫细胞化学、Western blot和RT-PCR检测结果显示,与IL-1β及OSM刺激组相比,SOCS-1、SOCS-3基因转染能明显上调CK18蛋白和mRNA的表达,同时抑制IL-1β及OSM诱导的α-SMA蛋白和mRNA的表达。此外SOCS-1、SOCS-3基因转染能抑制IL-1β及OSM诱导的p-STAT1蛋白的表达；ELISA检测结果显示,与对照组相比,SOCS-1、SOCS-3基因转染组细胞上清液中ColⅠ和FN蛋白的分泌明显减少。4 SOCS-1、SOCS-3基因转染对糖尿病小鼠肾脏炎症状态及肾小管上皮细胞转分化的影响①与糖尿病组相比,SOCS-1、SOCS-3基因转染组小鼠肾组织中SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的表达明显增强,提示SOCS-1、SOCS-3基因成功导入小鼠体内,并在蛋白水平获得高效表达。②CK18和α-SMA蛋白检测结果显示,SOCS-1、SOCS-3基因转染能明显抑制肾小管上皮细胞中α-SMA的表达并逐渐恢复CK18的表达。③RT-PCR结果显示,SOCS-1、SOCS-3基因转染能抑制肾小管上皮细胞中a-SMA mRNA的表达并使CK18 mRNA表达有所恢复明显。⑤流式细胞术检测巨噬细胞的标志蛋白CD68,结果显示,SOCS-1、SOCS-3基因转染可抑制CD68的表达。⑥ELISA结果显示,SOCS-1、SOCS-3基因转染后肾组织中IL-1β和OSM蛋白的表达明显下降。结论：①糖尿病小鼠肾组织中存在巨噬细胞浸润和炎症因子IL-1β、OSM及p-STAT1表达的增多,同时存在肾小管上皮细胞转分化现象,提示糖尿病肾组织存在炎症反应、小管上皮细胞转分化及JAK/STAT信号通路的激活。②IL-1β、OSM可刺激肾小管上皮细胞表达α-SMA并抑制CK18的表达,同时使p-STAT1的表达增多。而同时应用AG490干预可降低α-SMA和p-STAT1的的表达,并使CK18的表达部分恢复。提示IL-1β和OSM可通过激活JAK/STAT信号通路诱导肾近曲小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞。③SOCS-1、SOCS-3过表达能抑制IL-1β, OSM诱导的肾小管上皮细胞α-SMA和p-STAT1的表达,提示SOCS-1、SOCS-3基因可能通过对JAK/STAT信号途径的负反馈作用而抑制IL-1β、OSM诱导的HKC转分化。④过表达SOCS-1、SOCS-3基因能抑制巨噬细胞浸润、抑制炎症因子IL-1β和OSM的表达,同时降低肾小管上皮细胞中α-SMA的表达,提示SOCS-1、SOCS-3可减轻糖尿病肾脏的炎症反应并抑制肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化。