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目的:口腔鳞癌(OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一,然而口腔鳞癌的5年生存率仅30%-45%。本文将研究凋亡相关蛋白14-3-3δ和LKB1在口腔鳞癌细胞中的表达,以及14-3-3δ和LKB1在口腔鳞癌细胞凋亡或增殖调控中的相互关系,同时运用晶体学原理解析14-3-3δ和LKB1结合的分子基础,并通过结构设计突变、打破两者的结合,进一步验证14-3-3δ和LKB1的结合对口腔鳞癌细胞增殖或凋亡调控的影响。通过本研究,拟为生物学靶向治疗口腔鳞癌的靶点设计研究打下一定的结构基础,以期为口腔鳞癌提供一种新的治疗策略。方法:1.应用Real-time PCR技术与蛋白免疫印迹法分别在m RNA与蛋白水平检测14-3-3δ在口腔原代上皮细胞和口腔鳞癌细胞系CAL27的表达差异。通过流式细胞技术观察14-3-3δ基因表达沉默或过表达对口腔鳞癌细胞增殖或凋亡的影响。2.免疫共沉淀实验验证14-3-3δ和LKB1在口腔鳞癌细胞内的结合。同时应用蛋白质纯化技术得到14-3-3δ和LKB1的蛋白质复合物,然后通过晶体学方法解析得到14-3-3δ和LKB1的蛋白质复合物的结构。3.通过复合物的结构,设计LKB1突变质粒,并将突变质粒转染至口腔鳞癌细胞系CAL27,通过免疫共沉淀实验验证两者在细胞内的分离,并应用流式细胞技术进一步观察LKB1突变后对肿瘤细胞增殖或凋亡的影响。结果:1.口腔鳞癌细胞CAL27在mRNA与蛋白水平14-3-3δ的表达量都要高于口腔原代上皮细胞。14-3-3δ过表达质粒转入口腔鳞癌细胞系CAL27后,口腔鳞癌细胞发生了明显的增殖。14-3-3δ基因表达沉默后,口腔鳞癌细胞发生了明显的凋亡。2.免疫共沉淀实验显示在口腔鳞癌CAL27细胞系内14-3-3δ和LKB1发生了明显的结合,而在原代口腔上皮细胞内14-3-3δ和LKB1的结合不明显。计算机晶体结构软件分析14-3-3δ和LKB1晶体衍射结果显示:14-3-3δ和LKB1可在体外发生结合,并且14-3-3δ与LKB1的333-340位点发生结合。LKB1的336位点为苏氨酸,是磷酸化位点,是14-3-3δ与LKB1结合的关键位点。3.设计LKB1 336突变成丙氨酸,免疫共沉淀实验显示突变后的LKB1与14-3-3δ不发生结合。突变后的质粒转入细胞表达后,口腔鳞癌细胞系CAL27发生凋亡。