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研究目的小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)为一种恶性程度较高的肺部肿瘤,虽然只占所有肺癌的大约15%,但其诊治一直较为棘手。与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在靶向治疗方面的飞速发展相比,SCLC发生发展的潜在机制仍未可知,缺乏可用于临床靶向治疗的驱动基因,现有治疗手段仍然以传统的化疗和放疗为主。由于SCLC倍增时间短,虽然其对于化疗敏感,但很快就会出现复发转移,导致治疗失败和死亡。因此,化疗耐药的产生是限制小细胞肺癌患者临床疗效的重要障碍,涉及众多耐药相关基因的调控异常。前期研究表明:实验室建立的人小细胞肺癌耐药细胞株Letp/EP和H446/EP都具有多药耐药特性。与其相应亲本细胞系Letp和H446相比,耐药细胞系的自噬活性明显升高并与其耐药特性相关。本研究旨在寻找参与SCLC耐药表型形成的分子靶标,分析自噬调控的关键因子Beclin-1在SCLC细胞和组织中的表达水平及临床意义,人为调控Beclin-1的表达并验证其对SCLC化疗耐药的影响。利用生物信息学方法,结合高通量miRNA芯片筛选结果和荧光素酶活性试验筛选并验证诱导Beclin-1基因过表达的关键miRNA分子miR30a-5p,继而探索和阐明其在SCLC耐药中的功能。为探索克服SCLC化疗耐药的治疗靶点提供新的实验依据。研究方法1、人小细胞肺癌化疗耐药细胞株Letp/EP和H446/EP均由本实验室前期构建而成。采用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)和Western Blot法检测Beclin-1的表达。浓度依赖性诱导实验中在相同作用时间内以不同浓度依托泊苷(etoposide,VP16)(0,1,3μg/ml)联合对应不同浓度顺铂(cisplatin,DDP)(0,0.3,0.6μg/ml)处理亲本小细胞肺癌细胞,时间依赖性诱导实验中以(1μg/ml VP16+0.3μg/ml DDP)处理亲本细胞不同时间(0,3,5 d),采用q-PCR和Western Blot法检测Beclin-1的表达。2、收集92例明确诊断小细胞肺癌的病理组织标本,其中54例接受过依托泊苷(VP16)联合顺铂(DDP)方案的化疗,对标本中Beclin-1的表达运用免疫荧光和免疫组化的方法检测。所有病例密切随访,运用统计学方法分析Beclin-1与小细胞肺癌患者临床病理因素及化疗敏感性的相关性。3、与对应的亲本细胞相比,Beclin-1在耐药细胞中的表达显著增高。将Beclin-1小干扰RNA(siBeclin-1)转染至耐药细胞以调控Beclin-1的表达。Beclin-1在小细胞肺癌耐药细胞上的功能表型通过MTT、Western Blot、平板克隆形成实验以及流式细胞检测等方法,以反映其对小细胞肺癌细胞的化疗抵抗、自噬活性、凋亡程度、体外增殖能力和细胞周期分布的影响。4、利用三种免费开放的mirna在线分析数据库:mirtarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)、targetscanhuman7.0(http://www.targetscan.org)、和pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/),分析beclin-1基因3’-末端非编码序列中所有潜在的mirna结合位点,并将预测结果作交集分析。结合课题组前期研究成果和高通量mirna芯片筛选结果,有五条mirnas(mir-27a-3p、mir-5096、mir-30a-5p、mir-103a-3p和mir-24-3p)在耐药细胞中显著下调并与小细胞肺癌化疗敏感性密切相关。5、双荧光素酶报告基因验证mir-30a-5p对beclin-1的调控作用。mir-30a-5pmimics和mir-30a-5pinhibitor被分别转染进入耐药或亲本细胞以调控mir-30a-5p的表达,采用q-pcr和westernblot法检测小细胞肺癌耐药细胞中beclin-1表达的变化。6、采用mtt、westernblot、平板克隆形成实验和流式细胞技术验证mir-30a-5p的功能表型,并验证将mir-30a-5pmimics、mir-30a-5pinhibitor分别与sirna-beclin-1共转染至小细胞肺癌耐药细胞和亲本细胞后的功能改变。结果1、beclin-1在耐药sclc细胞中的表达显著增高。随着药物浓度的增加和作用时间的延长,beclin-1的表达进行性升高,呈现出浓度和时间依赖性。2、beclin-1表达水平被发现与tnm分期、淋巴结转移与否、有无血管侵袭相关。接受vp16联合ddp化疗方案(ep)治疗的小细胞肺癌患者中,beclin-1在化疗抵抗型患者中表达较化疗敏感型更高。3、在小细胞肺癌耐药细胞letp/ep和h446/ep中转染beclin-1小干扰rnasibeclin-1,人为使beclin-1表达下降后,vp16和ddp对耐药sclc细胞的半数抑制能力(ic50)明显降低,自噬减少,凋亡增加,细胞的体外增殖能力减弱,同时细胞周期出现g2/m期阻滞和s期减低。4、通过生物信息学软件分析,将同时被3个mirna/靶基因数据在线分析软件预测到的与beclin-1的3’-非编码区有作用的mirna取交集,并结合前期研究结果,mir-30a-5p被选为进一步研究对象。5、mir-30a-5p在耐药细胞中明显低表达,beclin-1为mir-30a-5p下游靶基因。在beclin-1高表达的耐药株细胞中人为上调mir-30a-5p表达后beclin-1表达明显下降,而在beclin-1低表达的亲本株细胞中干扰mir-30a-5p表达后beclin-1表达增高,mir-30a-5p与beclin-1之间呈负向调控关系。6、在亲本细胞Letp和H446中转染miR-30a-5p inhibitor后,亲本细胞对药物的敏感性减弱,自噬增加,凋亡减少,体外增殖能力增强;干扰Beclin-1表达能够部分逆转抑制miR-30a-5p后的影响。在耐药细胞Letp/EP和H446/EP中过表达miR-30a-5p能够促进细胞对药物的敏感,抑制自噬,诱导凋亡,降低体外增殖能力和介导细胞周期G0/G1期阻滞;干扰Beclin-1表达后无进一步叠加作用。结论1、Beclin-1在小细胞肺癌化疗耐药表型的形成中具有重要作用,抑制Beclin-1的表达可以促进小细胞肺癌化疗增敏、减少自噬、诱导凋亡、抑制增殖和改变细胞周期分布水平。2、MiR-30a-5p与Beclin-1呈负向调控,具抑癌基因作用,在小细胞肺癌中起化疗增敏,抑制自噬,诱导凋亡,减弱体外增殖以及细胞周期的再分布密切相关。3、Beclin-1为miR-30a-5p的直接靶基因,miR-30a-5p/Beclin-1信号轴的调控异常促进小细胞肺癌化疗耐药表型的形成。4、本研究分析了Beclin-1在小细胞肺癌中的表达及其与临床病理特征和预后的关系,为小细胞肺癌逆转化疗耐药和临床个体化治疗提供了实验依据和新的思路。