本课题中按常规方式建立内毒素耐受模型，初步探讨内毒素耐受状态下胸腺CD4+SP细胞TCRβ链CDR3区的变化及其意义。　　研究内容包括以下两个部分，分述如下：　　目的：　　第一部分 以5mg/kg浓度LPS腹腔注射，建立内毒素耐受模型并鉴定。利用MACS分选模型小鼠胸腺CD4+SP 细胞，结合Illumina Solexa 高通量测序技术，分析内毒素耐受状态下胸腺CD4+SP细胞的TCRβ链CDR3区的变化。　　第二部分 利用OVA转基因模型小鼠，观察内毒素耐受状态下，胸腺发育的CD4+SP细胞对特异性抗原识别及应答的改变。　　方法：　　第一部分：选取6-8周雌性C57BL/6小鼠，以5mg/kg浓度LPS腹腔注射，建立内毒素耐受模型，注射后72h和8d为实验组；以PBS腹腔注射后72h为对照组。为鉴定内毒素耐受 (endotoxin tolerance, ET) 模型，在LPS耐受模型后72h以10mg/kg浓度LPS大剂量攻击小鼠为耐受组；10mg/kg浓度LPS大剂量攻击小鼠为攻击组。24h 后观察两组小鼠生存率变化；HE 染色观察两组小鼠肺脏和肝脏脏器病理学变化，利用RT-PCR技术检测耐受组和攻击组肺脏和肝脏组织细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10的mRNA表达水平变化。建立耐受模型后，分离对照组和实验组小鼠的胸腺组织，利用免疫磁珠分选技术（ magnetic cell sorting，MACS）分选出胸腺中的CD4+SP 细胞，流式细胞术鉴定分选纯度，提取每组细胞基因组 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；随后将各组样本 DNA 送Adaptive Biotechnologies Immune SEQ公司（美国华盛顿医学院），运用多重PCR技术扩增各样本CDR3区，并结合高通量技术对各样本TCRβ链 CDR3区进行测序。测序结束后，利用生物信息学软件Immuno SEQ对3个实验样本原始序列进行分析。　　第二部分：选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在无菌条件下取其骨髓细胞，以20ng/ml浓度GM-CSF体外诱导培养7天，获得巨噬细胞，流式细胞术鉴定其纯度。利用免疫磁珠分选技术，分选 OVA 转基因（OT-II）小鼠脾脏 CD4+T 细胞； 将 1×105Mψ-OVA 和 4×105CD4+T 细胞共培养 24h，FACS 检测 CD4+T细胞相关功能分子CD62L和CD69的表达水平。以5×106 OT-Ⅱ骨髓细胞过继传输（Adoptive cell transfer, ACT）至Rag-1-/-小鼠体内，24h后再次分别过继传输2×106 Mψ和2×106 Mψ-OVA，24h后以0.5mg/kg浓度LPS腹腔注射，建立内毒素耐受模型，观察各组小鼠体重、胸腺重量， FACS 检测胸腺中OVA-specific-CD4+SP细胞比例及其功能相关分子CD62L、CD69、CD44的表达水平。模型后72h以2mg/kg浓度LPS高剂量攻击小鼠，24h后观察各组小鼠脾脏的重量，HE染色观察小鼠肺脏和肝脏的病理变化；利用RT-PCR技术检测实验组及对照组肺脏和肝脏组织细胞因子 TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、IL-4 及TGF-β的mRNA表达水平变化。FACS检测脾脏中OVA-specific-CD4+T细胞比例及其功能相关分子CD62L、CD69、CD44，功能相关分子IFN-γ和IL-4的表达水平。　　结果：　　第一部分： 耐受组小鼠生存率为 100%，而攻击组小鼠精神萎靡，行动缓慢，反应迟钝，竖毛，24h内全部死亡。肺脏和肝脏肉眼可见较为严重的病态变化。HE染色结果显示，与耐受组相比，攻击组小鼠肺泡壁明显增厚，淋巴细胞浸润增多，肝小叶结构紊乱。RT-PCR结果显示，与攻击组相比，耐受组肺脏中促炎因子TNF-α、IFN-γ表达明显下调（P<0.05）,抑炎因子IL-10表达下调（P<0.05）然而IL-4的表达无差异。肝脏组织中促炎因子IFN-γ的表达显著下调（P<0.05），抑炎因子IL-4和IL-10的表达明显增加（P<0.05）但促炎因子TNF-α也同时上调（P<0.05）。　　高通量测序结果分析如下：　　1、3组样本TCRβ链CDR3序列中Unique Productive序列/Total Productive序列数目分别为：Control组：9993/23102；72h组：9992/21079；8d组：9995/27549。　　2、 各组胸腺 CD4+SP 细胞样本反辛普森指数（1/DS）分别为：Control 组：59112.08；72h组：37188.8；8d组：29921.15。　　3、各组胸腺CD4+SP细胞样本TCRβ链CDR3 AA长度分布均呈现以12个氨基酸长度为主的高斯分布，且均高频取用丝氨酸（S）、丙氨酸（A）和甘氨酸（G）。　　4、各组样本高频扩增的前10条序列分析显示，Control组和模型8d组存在两条共同的AA序列为：CASSLGQYEQYF和CASSPGTGGYEQYF，而72h组与Control和8d组均无重叠序列。　　5、Control组中高频扩增的前20条克隆在72h和8d组中大多呈现低表达或无表达；在72h和8d组出现了同样的现象。　　6、72h与8d实验组和Control组三组中共有重叠序列208条，其中72h组中高频表达的前20条序列在Control组和8d组中大多呈现低表达。　　7、三组样本 TCRβ 链 CDR3 区 TRBV 基因家族均高频取用 TRBV13-02、TRBV19-01、TRBV03-01；TRBJ 基因家族均高频取用 TRBJ02-07、TRBJ02-05、TRBJ02-01。　　8、三组样本TCRβ链 CDR3区TRBV-TRBJ基因配对分析发现，72h组与Control和 8d 组均存在共同的优势配对（>2%）为 TRBV13-02-TRBJ02-07。此外，相比于对照组，在LPS刺激后72h和8d时，出现了新的V-J基因配对。　　第二部分： FACS结果显示，体外诱导巨噬细胞纯度达90%以上。显微镜下观察发现，与SP-OVA组相比，Mψ-SP组和Mψ-OVA组中克隆数目显著增多，且Mψ-OVA组中克隆数目增加更为明显；同时，FACS检测得知，活化相关分子CD62L、CD69发生了明显改变（P<0.05）。分别对实验组和对照组小鼠体重及胸腺重量检测发现，Mψ和Mψ-OVA两组小鼠体重在前3天均持续下降，第4天开始恢复，第7天恢复到正常水平；此外，与对照组相比，两组小鼠的胸腺重量在模型后72h显著降低（P<0.05），8d后逐渐恢复至正常水平。流式结果显示，与Control组相比，LPS注射72h后，其OVA-specific-CD4+SP细胞比例在Mψ和Mψ-OVA组中均显著增加(P<0.05)；注射8d后其比例明显下降(P<0.05)。此外，比较Mψ和Mψ-OVA组发现， LPS注射后72h ， Mψ-OVA组中OVA-specific-CD4+SP细胞比例明显低于Mψ组（P<0.05）。我们检测了其活化相关分子的表达水平发现，Mψ组中，与Control组相比，LPS注射后72h和8d CD69的表达无明显变化，CD62L的比例在72h时明显升高（P<0.05），8d时下降（P<0.05），但仍高于Control组（P<0.05）；CD44的比例在三组中均无明显变化。对Mψ-OVA组进行分析发现，相比于Control组，LPS注射后72h，CD69的比例显著升高（P<0.05）；CD62L的表达在LPS注射72h后显著上调（P<0.05），而在注射后8d显著下调（P<0.05）；CD44则无明显改变。进一步比较Mψ和Mψ-OVA组发现，LPS注射后8d，Mψ-OVA组较Mψ组CD62L的表达明显下降（P<0.05）。其他无明显变化。　　攻击实验结果分析显示，Mψ组脾脏的体积和重量较Control组和Mψ-OVA组明显增大（P<0.05）。Mψ和Mψ-OVA两组小鼠肺脏和肝脏HE染色提示，与Mψ-OVA组相比，Mψ组肺泡壁明显增厚，肺脏中淋巴细胞浸润增多，肝小叶结构紊乱。RT-PCR检测发现，与Mψ组相比，Mψ-OVA组肺脏中促炎因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α的表达明显下调（P<0.05），抑炎因子IL-10和TGF-β的表达明显上调（P<0.05），IL-4无明显改变；而肝脏中细胞因子的表达均无明显差异。随后，流式结果分析显示，与对照组相比，实验组脾脏中OVA-specific-CD4+T的比例明显增加（P<0.05），且Mψ组其比例高于Mψ-OVA组（P<0.05）；此外，进一步对脾脏中OVA-specific-CD4+T细胞功能相关分子CD62L、CD69、CD44、IFN-γ、IL-4检测发现，与Control组相比，Mψ和Mψ-OVA组CD69和CD44的表达显著增加（P<0.05）；此外，与Mψ组相比，Mψ-OVA组中CD69的比例上调更为明显（P<0.05）。同时，攻击实验结果显示：脾脏OVA-specific-CD4+T细胞功能分子IFN-γ、IL-4的表达情况，与Control组相比，Mψ组中IFN-γ和IL-4的表达明显上调（P<0.05）。此外，与Mψ组相比，Mψ-OVA组IFN-γ和IL-4的表达明显下调（P<0.05）。　　结论：　　第一部分：内毒素耐受状态下胸腺CD4+SP细胞TCRβ链CDR3区发生了改变。　　第二部分：内毒素耐受状态下胸腺中 OVA-specific-CD4+T 细胞对特异性抗原的识别和应答均发生了显著改变，同时有利于内毒素耐受的建立。