铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos，P．aeruginosa，PA)，是医院内感染常见的条件致病菌之一，且PA对多种抗生素存在天然和获得的多重耐药性，临床治疗十分困难，尤其在重症监护室，一旦感染，病死率极高。因此对PA耐药机制的研究，一直是国内外学者研究的重点和难点，但PA耐药机制非常复杂，尤其是其形成多重耐药的机制一直难以确定。外科重症监护室(Surgical Intensive CareUnit，SICU)是PA感染最严重的科室，耐药率高，耐药谱广，常表现为多重耐药。因此，为了解北京大学第一医院SICU铜绿假单胞菌多重耐药机理，我们进行了如下研究：1．耐药表型及β-内酰胺酶的基因型测定2001年7月至2004年7月，从北京大学第一医院SICU临床标本中分离出49株非重复PA，并经脉冲场凝胶电泳证实为非流行株。按美国国家临床试验室标准委员会(NCCLS，2002年)所推荐的琼脂倍比稀释法，测定抗生素的最小抑菌浓度(MICs)；提取β-内酰胺酶进行三维水解试验及等电聚焦电泳(IEF)；通过一系列超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及金属酶(MBLs)特异引物扩增其耐药基因。结果：受检49株PA均对4种或4种以上抗生素耐药，表现为多重耐药，其中对三代头孢菌素头孢噻肟、喹诺酮类环丙沙星和左氧沙星、碳青霉烯类亚安培南耐药率较高，分别为98％、80％、92％和84％。而对哌拉西林+他唑巴坦(特治星)、第四代头孢菌素头孢吡肟、氨基糖苷类抗生素阿米卡星耐药率较低，分别为6％、6％、4％。48株菌产β-内酰胺酶(98％)，其中37株产AmpC酶(75.5％)，11株产ESBLs酶(22.4％)，未发现产金属酶的菌株。所有被三维试验确定为产ESBLs的11株PA，有8株扩增到OXA酶编码基因。以SHV，CTX-M1，CTX-M3，CTX-M10，VEB，IMP，VIM特异引物进行PCR扩增，未发现阳性菌株。2．4种主动外排系统高表达情况及调控机理研究用Western印迹测定外排泵MexCD-OprJ、MexEF-OprN的结构蛋白OPrJ、OprN表达情况；用半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR分别测定MexAB-OprM、MexXY-OprM结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平，借此来判断4种外排泵表达情况。结果：49株多重耐药PA，31株高表达主动外排系统(63％)，其中27株菌高表达MexAB-OprM，3株菌高表达MexXY-OprM，13株菌表达MexCD-OprJ，14株菌表达MexEF-OprN，并且多重表达现象非常普遍，17株菌同时表达2种或2种以上外排泵，其中PA22、PA39两株菌同时表达4种，PA23、PA45、PA13三株菌同时表达3种。经统计学分析，在MexAB-OprM高表达组和低表达组美罗培南、头孢哌酮／舒巴坦的耐药率有显著差异，而其它抗生素耐药率虽然无显著差异，但MexAB-OprM高表达组大部分菌株对哌拉西林／克拉维酸、头孢噻肟、氨曲南的MIC比参考菌PA01高2-32倍，这些抗生素均为MexAB-OprM外排泵很好的底物。MexXY-OprM外排泵高表达的菌株PA39，表现为对庆大霉素高度耐药(MIC为512)，加泵抑制剂后，MIC下降4倍，说明MexXY-OprM高表达是PA39对庆大霉素高度耐药的机制之一。MexCD-OprJ、MexEF-OprN高表达组和未表达组对14种抗生素MIC及耐药率虽然无显著性差异，但表达MexCD-OprJ系统的13株菌对第四代头孢菌素头孢吡肟的MIC比参考菌PA01高2-32倍，PA31、PA34两株菌同时对环丙沙星和左氧沙星耐药，头孢吡肟、环丙沙星和左氧沙星均为MexCD-OprJ的底物，这些菌株对此三种药物的耐药可能与MexCD-OprJ表达有关。表达MexEF-OprN外排系统的PA8、PA22、PA23、PA39、PA41、PA45、PA46 7株菌，对亚胺培南的MIC比参考菌PAO1高16-32倍，PA23、PA39、PA45、PA14同时对环丙沙星和左氧沙星耐药，推测这些菌株对此三种药物的耐药可能与MexEF-OprN表达有关。随机选择10株mexA高表达的菌株、2株mexX高表达的菌株、5株OprJ表达的菌株，分别扩增其调控基因mexR、moxZ、nfxB，测序并与genebank中公布的序列比较，发现7株菌发生mexR基因突变，出现氨基酸替代，其中PA18、PA43、PA48、PA49四株菌发生69Thr-Ala替代，PA14、PA36两株菌发生130Thr-Ser替代，PA41发生95Leu-phe替代，PA22菌株mexR基因在7773和7775之间插入碱基a，在32位氨基酸提前出现终止密码子，使长度为184个氨基酸的MexR蛋白截短为31个氨基酸，PA46、PA39两株菌未发现mexR基因突变。2株mexX高表达的菌株均发生基因mexZ突变，出现氨基酸替代，其中PA39发生7Glu-Gly替代，PA22发生21Glu-Asp和26Glu-Lys替代。5株OprJ表达的菌株中，2株菌发生nfxB基因突变，出现氨基酸替代，其中PA31发生55Glu-Gln替代，PA33发生82Arg-Leu替代，3株菌未发现nfxB基因突变。因PA36、PA41、PA48的mexR基因序列未见报导，我们把其序列提交到genebank，申请的序列号分别为AY899299、AY899300、AY899301。3．外膜孔蛋白OprD水平测定为进一步了解PA对碳青霉烯的耐药机理，我们用Western印迹测定外膜孔蛋白OprD的表达情况，并分析了其表达水平对其他抗生素耐药性的影响。结果：从SICU分离的49株多重耐药PA，与PA01相比，41株OprD降低或缺失，其中，18株表达降低，23株表现为丢失。8株菌正常表达了OprD，其中7株对碳青霉烯敏感，1株(PA42)对美罗培南耐药但对亚胺培南敏感。41株OprD缺失或低表达菌，均表现为对亚胺培南耐药(MICs16～32ug／ml)；大部分(27株)对美罗培南敏感，只有14株对美罗培南耐药。OprD表达量，在亚胺培南耐药组(中位数=2.00，Q1／Q3=2／2)和敏感组(中位数=0.21，Q1／Q3=0.00／0.73)有显著差异(u=0.5，p=0.007＜0.01)。但在美罗培南耐药组(中位数=1.00，Q1／Q3=1／2)和敏感组(中位数=0.21，Q1／Q3=0.00／0.73)无显著差异(u=231.5，p=0.59＞0.05)。在OprD正常表达组和低表达组对亚胺培南耐药率有显著差异，而对美罗培南耐药率无显著差异。OprD缺失，不但影响碳青霉烯的敏感性，同样影响氟诺喹酮和β-内酰胺的敏感性，在OprD正常表达组和低表达对环丙沙星、左氧沙星、氨曲南、哌拉西林耐药率均有显著差异。通过本研究我们得到如下结论：1．本院SICU多重耐药铜绿假单胞菌检出率很高，持续高产AmpC酶是其耐药的主要β-内酰胺酶酶学机制，OXA酶是超广谱β-内酰胺酶的主要类型。未检出其他超广谱β-内酰胺酶及IMP、VIM金属酶。2．主动外排系统在SICU多重耐药铜绿假单胞菌表达率很高，是此菌多重耐药机制之一；外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、nfxB、mexZ发生变异有关，同时存在其它调控机制。3．外膜孔蛋白OprD丢失主要引起亚胺培南耐药，同时对环丙沙星、左氧沙星、氨曲南、哌拉西林耐药性也有一定影响。