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目的：肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,2010年中国卫生统计年鉴显示,肺癌死亡率位居我国恶性肿瘤死亡率的第1位[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的75%-85%[2-3],手术、放疗、化疗及靶向治疗是治疗NSCLC的主要手段。但对于晚期非小细胞肺癌患者,化疗已达到其疗效平台,而靶向药物如EGFR-TKI仅对EGFR基因突变型有效及产生原发性和获得性耐药均限制了它的使用。我院承担的“十一五”国家科技攻关计划结果显示：益气除痰法可提高Ⅲ、Ⅳ期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存期和生活质量[4]。前期的动物与细胞实验也发现：益气除痰方能明显降低Lewis肺癌C57BL/6J小鼠肿瘤体积、瘤重及肺转移灶,益气除痰方含药血清可抑制人肺腺癌细胞株A549细胞的侵袭和转移能力[5-6]。本研究对益气除痰法治疗非小细胞肺癌(NSCLC)患者进行生存分析,并通过检测JNK信号通路和泛素-蛋白酶体途径(UPP)探讨益气除痰方的作用机制及可能的作用靶点,为益气除痰法治疗非小细胞肺癌(NSCLC)提供更多的科学依据。方法：1.益气除痰法治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存分析采用病例-对照研究方法收集晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者62例进行随访,依据既往接受的治疗分为中医组和中西医组,使用Kaplan-Meier法(乘积极限法)绘制两组患者的总生存期(0S)与疾病无进展生存期(PFS)的生存曲线,使用log-rank检验比较两组生存曲线,最后使用COX比例风险回归模型对两组患者的生存资料进行多因素分析。2.益气除痰方含药血清对人肺腺癌细胞株A549细胞的形态、增殖、凋亡及对JNK/SAPK信号通路及泛素-蛋白酶体途径(UPP)的影响(1)益气除痰方含药血清及空白血清的制备：SD大鼠40只(180-220g)随机分成益气除痰方组和空白对照组,连续灌胃7天,末次给药1h后从腹主动脉取血,静置离心后滤膜除菌,分装于EP管中-20℃保存备用。(2)益气除痰方含药血清对细胞形态的影响：光学显微镜下观察各组A549细胞的细胞形态并拍照。(3)益气除痰方含药血清对细胞增殖的影响：MTT法检测各组A549细胞生长的抑制率(1R)。(4)益气除痰方含药血清对细胞凋亡的影响：流式细胞术(AnnexinV-FITC/PI双染色法)测定各组A549细胞凋亡率。(5)益气除痰方含药血清对JNK/SAPK信号通路的影响：Western blotting检测各组A549细胞的JNK和p-JNK蛋白表达。(6)益气除痰方含药血清对泛素-蛋白酶体途径(UPP)的影响：激光共聚焦显微镜观察各组A549细胞的ubiquitin免疫荧光表达。成果：1.益气除痰法治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存分析(1)中医组与中西医组的中位生存期分别为327天(10.9个月)和339天(11.3个月),一年生存率分别为39.6%和39.5%,差异无统计学意义(P=0.695)。(2)中医组与中西医组的中位疾病无进展生存期分别为189天(6.3个月)和193天(6.4个月),一年疾病无进展生存率分别为23.8%和28.7%,差异无统计学意义(P=0.896)。(3)疾病分期与治疗前PS评分是影响生存期的预后因素,Ⅳ期的死亡风险为ⅢB期的2.27倍(P=0.014),PS=3分的死亡风险是PS=1分的8.867倍(P<0.001)是PS=2分的4.515倍(P=0.003)。2.益气除痰方含药血清对人肺腺癌细胞株A549细胞的形态、增殖、凋亡及对JNK信号通路及泛素-蛋白酶体途径(UPP)的影响(1)益气除痰方含药血清对细胞形态的影响：使用胎牛血清及空白血清培养的A549细胞贴壁良好,具有人肺腺癌细胞的典型形态学特征,细胞排列不规则,外形以梭形和多角形为主。不同浓度的含药血清培养A549细胞后,部分A549细胞体积缩小,未能贴壁生长,细胞质及细胞核固缩,细胞形态呈现为小圆形,其中以30%含药血清组及35%含药血清组的细胞形态改变最为明显。(2)益气除痰方含药血清对细胞增殖的影响：空白血清对A549细胞增殖无影响,各含药血清(10%、20%、25%、30%、35%)对A549细胞增殖均有抑制作用(P<0.001),其中30%含药血清对A549细胞生长的抑制率(IR)最高(P<0.01)；除10%含药血清外,其余各含药血清的生长抑制作用均随培养时间的延长而增高(P<0.05)。(3)益气除痰方含药血清对细胞凋亡的影响：空白血清组、10%含药血清组、20%含药血清组、25%含药血清组、30%含药血清组、35%含药血清组干预A549细胞48h后的细胞凋亡率分别为：(0.133±0.057)%、(2.867±0.751)%、(9.167±1.401)%、(17.100±1.345)%、(23.833±1.861)%、(20.266±1.724)%。空白血清不能诱导A549细胞凋亡,各含药血清干预A549细胞48h后,均可诱导A549细胞凋亡,与空白血清比较差异均有统计学意义(P<0.05)；各组凋亡率随含药血清浓度升高有上升趋势,其中30%含药血清的细胞凋亡率最高(P<0.01)。(4)益气除痰方含药血清对JNK/SAPK信号通路的影响：空白血清组、10%含药血清组、20%含药血清组、25%含药血清组、30%含药血清组、35%含药血清组的JNK蛋白相对表达量(JNK/GAPDH)分别为：0.233±0.019、0.239±0.003、0.243±0.006、0.240±0.008、0.234±0.006、0.244±0.006；各组的p-JNK蛋白相对表达量(p-JNK/GAPDH)分别为：0.687±0.004、0.578±0.014、0.573±0.009、0.536±0.007、0.508±0.006、0.573±0.005。统计显示,各组JNK蛋白相对表达量无明显差异；各含药血清组P-JNK蛋白相对表达量均低于空白血清组(P<0.001),其中30%含药血清组p-JNK蛋白相对表达量最低,差异有统计学意义(P<0.01)。(5)益气除痰方含药血清对泛素-蛋白酶体途径(UPP)的影响：ubiquitin在胎牛血清组和空白血清组的A549细胞中强表达,在细胞质和细胞核中呈现明亮的绿色荧光；而在30%含药血清组中,ubiquitin在细胞质和细胞核中均呈现较弱的绿色荧光,免疫荧光表达明显减弱。结论：益气除痰法可延长晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的总生存期和疾病无进展生存期,疾病分期与治疗前PS评分是影响非小细胞肺癌患者生存期的预后因素。益气除痰方含药血清可抑制A549细胞增殖,诱导A549细胞凋亡,其作用机制可能与抑制JNK/SAPK信号通路及抑制泛素-蛋白酶体途径(UPP)有关,但具体的作用靶点仍需进一步的研究进行探索。