研究背景：　　肺癌是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居所有恶性肿瘤的首位，且呈逐年上升的趋势。根据世界卫生组织国际癌症研究署（WHO/IARC）最新统计数据显示，2012年，全球肺癌新发病例180万人，死亡159万人，占所有肿瘤发病和死亡人数的12.9％和19.4%，是全世界发病率和死亡率最高的肿瘤。尽管近年来肺癌的临床诊疗措施取得了很大的进步，但其5年生存率仍仅约15%。大量流行病学研究结果显示，环境因素如吸烟，空气污染和职业化学毒物暴露等是肺癌发病的危险因素。而现代医学研究表明，肺癌的发生发展是一个多步骤、多因素的过程，是环境因素和遗传因素共同作用的结果。目前，对肿瘤的研究主要集中在基因组学和蛋白质组学领域。近年来，与肿瘤相关的代谢组学研究也逐渐受到重视，肿瘤的发生发展是细胞代谢网络发生异常改变，导致细胞失去正常生长规律而出现的细胞异常增殖。　　肿瘤细胞具有独特的能量代谢特征：①肿瘤细胞即便在有氧条件下，也主要以糖酵解方式获取能量（有氧糖酵解），而不是氧化磷酸化，即具有“Warburg效应”；②增加对糖、谷氨酰胺的摄取；③合成更多的ATP、氨基酸、核酸和脂类；④影响糖代谢过程中相关酶的活性等。肿瘤产能方式的转变，导致肿瘤细胞内部发生一系列的生理变化。胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins，IGFBPs)是一类多功能细胞增殖调控因子，其通过与胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor，IGFR)竞争结合胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)而调控IGFs的生物学功能，与恶性肿瘤的代谢调控密切相关。IGFBP4作为 IGFBPs家族的一个重要核心成员，其主要生物学效应是抑制IGFs的促细胞增殖和抗凋亡活性的功能，从而在肿瘤代谢过程中发挥重要作用。多项研究发现过表达IGFBP4，可以减缓包括前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长和增殖。已有研究报道IGFBP4在肺癌组织中呈低表达状态，且其表达水平与肺癌细胞的恶性分化程度密切相关，IGFBP4的表达水平越低，则细胞恶化程度越高。　　肿瘤细胞中，调控基因表达的机制很多，其中长链非编码 RNA（ long non-coding RNA，lncRNA）是近年来国际肿瘤生物学领域中的研究热点。lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子，不具有编码蛋白质的能力，但能在RNA水平上行使其生物学功能，主要通过表观遗传学、转录及转录后水平的方式调控基因的表达与转录。越来越多的研究结果表明，lncRNA不仅参与物质代谢、胚胎发育、基因组印记等，而且与人类肿瘤的生物学功能关系密切，在肿瘤组织中异常表达的lncRNA具有作为诊断和治疗肿瘤的生物标志物的潜能。研究发现，MALAT-1在肺癌组织中高表达，且其表达水平与肿瘤细胞恶性分化程度、远处转移密切相关；MALAT-1表达水平高，则生存期短，预后差，提示MALAT-1可作为判断肺癌患者预后的生物靶标。HOTAIR也被证实在肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤中高表达，对肿瘤的增殖具有明显的促进作用。　　已有研究报道发现存在长链非编码 RNA参与肿瘤的代谢调控过程，如lncRNA PCGEM1通过激活c-Myc癌基因和雄激素受体(androgen receptor，AR)而参与调控前列腺癌的代谢过程；lncRNA UCA1通过调控mTOR-STAT3/microRNA143-HK2信号通路而使膀胱癌细胞能够适应代谢压力而获得生存优势，但尚未有相关研究报道是否存在lncRNA参与肺癌的代谢调控过程，于是我们通过生物信息学分析发现IGFBP4基因上游区域存在一个长链非编码 RNA lnc-IGFBP4-1，且我们的前期小样本人群预实验发现，在肺癌组织中lnc-IGFBP4-1与 IGFBP4的表达水平呈负相关关系。因此，我们在本课题探索lnc-IGFBP4-1是否通过调控IGFBP4的功能，影响细胞的代谢过程，进而在肺癌的发生发展进程中发挥重要作用，并为肺癌的预防和治疗提供一种新的策略。　　方法：　　1.159例人肺癌组织及其癌旁正常肺组织的lnc-IGFBP4-1和IGFBP4基因的表达水平采用 qRT-PCR方法进行检测。同时，分析 lnc-IGFBP4-1的表达水平与肺癌病例临床特征的关系。　　2.构建lnc-IGFBP4-1的慢病毒过表达质粒及其对照质粒，包装慢病毒，感染人肺癌细胞系PC-9，使其稳定过表达lnc-IGFBP4-1，并同时设置空白对照组细胞，通过一系列体内外功能学实验检测lnc-IGFBP4-1对肺癌发生发展的影响。应用CCK8细胞增殖实验和平板克隆形成实验分析过表达lnc-IGFBP4-1对肿瘤细胞增殖能力的影响；利用流式细胞术分析细胞周期分布情况；Transwell迁移和侵袭实验分析过表达lnc-IGFBP4-1对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。此外，采用裸鼠成瘤实验分析过表达lnc-IGFBP4-1对肿瘤细胞增殖能力的影响。　　3.探讨lnc-IGFBP4-1与肺癌细胞能量代谢的关系，通过CellTiter-Glo?萤光细胞活性检测试剂对lnc-IGFBP4-1过表达组和空白对照组细胞内的ATP进行定量检测；此外，单独使用和联合使用糖酵解抑制剂2-DG和线粒体氧化磷酸化抑制剂Rho123处理细胞，定量检测lnc-IGFBP4-1过表达组和空白对照组细胞内的ATP；同时，利用qRT-PCR方法检测在无任何药物处理及不同药物处理的情况下，lnc-IGFBP4-1过表达组和空白对照组细胞内一系列参与调控肿瘤细胞糖代谢的相关酶GLUT1、HK2、ALODA、PGK1、PKM2、PDK1、LDHA和G6PDH基因mRNA表达水平的变化。　　结果：　　1．肺癌组织中lnc-IGFBP4-1的表达水平高于同一个体匹配的癌旁正常肺组织的表达水平(128例vs.31例，P＜0.001)，且lnc-IGFBP4-1高表达，与肺癌临床分期(III+IV vs. I+II，P=0.007)、肿瘤局部浸润深度(T3+T4 vs. T1+T2， P=0.041)、淋巴结转移(N1+N2+N3 vs. N0，P=0.044)及远处转移(M1 vs. M0， P=0.034)存在显著的正相关。同时，发现肺癌组织中IGFBP4基因的表达水平低于同一个体匹配的癌旁正常肺组织的表达水平(29例vs.130例，P＜0.001)，且IGFBP4与lnc-IGFBP4-1的mRNA表达水平存在负相关关系(r=-0.27， P＜0.001)。　　2．利用慢病毒过表达载体，成功构建稳定过表达 lnc-IGFBP4-1的肺癌细胞株PC-9。CCK8细胞增殖实验中，lnc-IGFBP4-1过表达组的OD值高于空白对照组细胞的OD值(P＜0.001)；平板克隆形成实验中，lnc-IGFBP4-1过表达组的细胞克隆数明显高于空白对照组的细胞克隆数(232±13 vs.132±41， P＜0.001)。流式细胞周期实验中，与空白对照组相比，过表达 lnc-IGFBP4-1可引起肺癌细胞G0-G1期比例下降(36.6%±8.81%vs.48.4%±9.12%，P＜0.05)，而S期比例显著增高(56.9%±7.47%vs.43.7%±8.61%，P＜0.05)。Transwell迁移实验中下移至微孔膜下层细胞的数量，lnc-IGFBP4-1过表达组显著高于空白对照组(370±41 vs.203±31，P＜0.001)；Transwell侵袭实验中穿过基质胶而下移到滤膜下层细胞的数量，lnc-IGFBP4-1过表达组明显高于空白对照组(204±41 vs.135±29，P＜0.001)。裸鼠成瘤实验中，与空白对照组相比， lnc-IGFBP4-1过表达组裸鼠的肿瘤生长速度明显快，且肿瘤体积也明显大(P＜0.05)，在第24天时，lnc-IGFBP4-1过表达组裸鼠的肿瘤体积为(636±64.1) mm3，明显大于空白对照组裸鼠的肿瘤体积(441±58.5) mm3(P＜0.05)。　　3．定量检测 lnc-IGFBP4-1过表达组和空白对照组细胞内的ATP，发现lnc-IGFBP4-1过表达组细胞内的ATP含量比空白对照组增加了17.5%(P＜0.001)；为了探讨lnc-IGFBP4-1对肺癌细胞能量代谢具体过程的影响，本实验用不同药物处理细胞，发现单独使用糖酵解抑制剂2-DG处理， lnc-IGFBP4-1过表达组和空白对照组细胞内的ATP含量与相应无任何药物处理组相比，分别下降了49.5%和19.4%(P＜0.001)；单独使用氧化磷酸化抑制剂Rho123处理，lnc-IGFBP4-1过表达组和空白对照组细胞内的ATP含量与相应无任何药物处理组相比，差异无显著性意义(P＞0.05)；而联合使用2-DG和Rho123处理，lnc-IGFBP4-1过表达组和空白对照组细胞内的ATP含量与相应无任何药物处理组相比，分别下降了53.8%和27.2%(P＜0.001)。同时，相应检测lnc-IGFBP4-1过表达组和空白对照组的肿瘤细胞糖代谢相关酶基因mRNA表达水平的变化。在无任何药物处理的情况下，lnc-IGFBP4-1过表达组肿瘤细胞糖代谢相关酶HK2、PDK1和LDHA基因的mRNA表达水平，比空白对照组相应酶的表达水平分别上升了28.9%、22.0%和12.3%(P均＜0.05)，其余酶的表达水平在两组细胞间均无显著性差异(P均＞0.05)。为了探讨lnc-IGFBP4-1对肿瘤细胞糖代谢相关酶的具体影响，本实验用不同药物处理细胞，发现单独使用糖酵解抑制剂2-DG处理，lnc-IGFBP4-1过表达组细胞内的HK2、PDK1和LDHA基因的mRNA表达水平显著下调，分别是空白对照组相应酶表达水平的(0.40±0.04)倍、(0.71±0.12)倍和(0.66±0.04)倍(P均＜0.05)，其余酶的表达水平在两组细胞间均无显著性差异(P均＞0.05)；单独使用氧化磷酸化抑制剂Rho123处理，肿瘤细胞糖代谢相关酶基因的mRNA表达水平在两组细胞间均无显著性差异(P均＞0.05)；联合使用2-DG和Rho123处理，lnc-IGFBP4-1过表达组细胞内的HK2、PDK1和LDHA基因的mRNA表达水平显著下调，分别是空白对照组相应酶表达水平的(0.21±0.02)倍、(0.56±0.19)倍和(0.64±0.06)倍(P均＜0.05)，其余酶的表达水平在两组细胞间均无显著性差异(P均＞0.05)。　　结论：　　1. lnc-IGFBP4-1在肺癌组织中的表达水平显著高于其癌旁正常肺组织，且lnc-IGFBP4-1能明显促进肺癌的临床进展，而 IGFBP4在肺癌组织中的表达水平明显低于其癌旁正常肺组织，且 IGFBP4与lnc-IGFBP4-1的mRNA表达水平存在负相关关系。　　2.慢病毒过表达肺癌细胞株中，lnc-IGFBP4-1在体内外均能促进肿瘤细胞的生长、增殖和转移。　　3. lnc-IGFBP4-1可显著上调细胞内的ATP含量，可能是通过促进肿瘤细胞的糖酵解通路，并在mRNA水平上影响参与调控肿瘤细胞糖代谢的相关酶HK2、PDK1和LDHA基因的表达，从而促进肿瘤细胞的生存。