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研究背景牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)具有一定的多向分化潜能,可分化为成牙本质样细胞,故成为牙髓及牙体硬组织再生的焦点。组蛋白修饰在干细胞分化中的作用受到越来越多的关注。组蛋白乙酰化后使DNA更容易与转录因子启动子区域相结合,促进基因转录。组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)共同控制染色质各区域核心组蛋白的乙酰化程度。LMK-235为HDAC4、5特异性抑制剂,本实验使用LMK-235体外作用于DPCs,探讨其在DPCs成牙本质细胞向分化中的作用及可能的机制。研究内容第一章DPCs的体外分离、培养和鉴定一.方法1.DPCs的分离培养:酶组织块消化法分离培养细胞;2.DPCs的干细胞特性的鉴定:①MTT法检测细胞增殖,②流式细胞仪检测表面标记物(CD29、CD44、CD90、CD45、CD31和CD34),③对细胞行成骨、成脂、成软骨诱导,21天后分别进行茜素红、尼罗红、阿利新蓝染色。二.结果1.DPCs呈长梭形贴壁生长,增殖迅速;2.细胞表面标记物的检测:流式细胞仪检测CD29、CD44、和CD90表达呈(+),CD45、CD31 和 CD34 表达呈(-);3.多向分化能力检测:细胞经矿化诱导后茜素红染色可见矿化结节,经成脂诱导后尼罗红染色可见脂滴,成软骨诱导后阿利新蓝染色可见蓝染。第二章LMK-235对DPCs生物学特性的影响一.方法1.细胞增殖水平的检测:MTT法检测不同浓度LMK-235(0、50、100、250、500及1000nM)对DPCs增殖的影响;2.成牙本质分化相关因子的检测:qRT-PCR检测ALP、Runx2、DSPPmRNA;3.HDAC4、HDAC5 蛋白检测:Western blot检测 OnM及100nM组细胞HDAC4、HDAC5蛋白表达。二.结果1.LMK-235对细胞增殖的影响:高浓度LMK-235对细胞增殖有抑制作用,低浓度时则无明显影响;2.低浓度LMK-235对ALP、Runx2、DSPP mRNA表达具有促进作用,且在100nM时作用最为明显;3.100nM LMK-235可明显抑制DPCs中HDAC4蛋白表达。第三章 LMK-235对DPCs成牙本质细胞向分化的作用一 ·方法1.细胞分组:对照组、LMK-235组、MI组及MI+LMK-235组;2.成牙本质分化相关因子的检测:细胞培养7天时检测ALP活性,第21天时茜素红染色检测矿化结节形成情况,第7、14、21天,qRT-PCR检测ALP、DSPP、Runx2、OCN 基因表达;Western blot 检测 DSPP、Runx2 蛋白表达。二.结果1.LMK-235可升高DPCs中ALP活性并促进矿化结节的形成;2.LMK-235可促进DPCs中成牙本质相关因子mRNA及蛋白的表达,且在细胞分化早期作用更为明显。第四章LMK-235调控DPCs成牙本质分化的作用机制第一部分DSPP启动子区域组蛋白乙酰化在LMK-235调控DPCs成牙本质细胞向分化中的作用一.方法1.细胞分组..对照组、LMK-235组、MI组及MI+LMK-235组。2.Western blot检测组蛋白H3、H4、乙酰化组蛋白H3、H4蛋白表达情况;3.染色质免疫共沉淀:检测细胞内H3K27Ac与DSPP启动子区域结合情况。二.结果1.LMK-235及矿化诱导的应用可促进DPCs内组蛋白H3乙酰化水平;2.MI+LMK-235组H3K27Ac与DSPP启动子区域结合高于MI组。第二部分VEGF/AKT参与LMK-235介导的DPCs成牙本质细胞向分化一.方法1.将细胞分为4组:对照组、LMK-235组、MI组及MI+LMK-235组。第7、14、21 天后 qRT-PCR 检测 VEGF、AKT、mTOR mRNA 的表达,Western blot检测AKT、p-AKT蛋白表达情况。2.使用AKT通路抑制剂Wortmannin,将细胞分为三组:MI组、MI+LMK-235组及MI+LMK-235+Wortmannin组。ALP染色检测ALP活性,茜素红染色检测矿化结节形成情况,qRT-PCR及Western blot检测ALP、DSPP、Runx2的表达。二.结果1.LMK-235在DPCs分化过程中可使VEGF、ATK mRNA及p-AKT蛋白的表达上调;2.Wortmannin可部分抑制LMK-235促进的ALP活性、矿化结节的形成及ALP、DSPP、Runx2基因及蛋白表达。结论1.组织块酶消化法可成功分离培养出人牙髓细胞,细胞贴壁生长,增殖迅速,可表达干细胞表面标记物,具有多向分化潜能;2.100nM LMK-235可通过增加ALP活性、促进矿化结节的形成、促进成牙本质向分化相关因子的表达来诱导细胞分化;3.LMK-235可上调细胞内组蛋白H3乙酰化水平,通过促进H3K27Ac与DSPP启动子区域结合调控DSPP表达及激活VEGF/AKT通路双向作用促进DPCs成牙本质向分化。