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目的:组织蛋白酶B(Cathepsin B)是溶酶体内主要组织蛋白酶之一,而C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)是Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming,ROCK)下游的蛋白,在缺血再灌注介导细胞凋亡过程中,这两种蛋白起着非常重要的作用。探讨大鼠脑缺血再灌注中Cathepsin B与JNK信号通路的关系,阐明大鼠脑缺血再灌注中溶酶体介导神经细胞凋亡的机制。方法:将10-12周龄,体重在240-280克的健康雄性SD鼠随机分成假手术组、模型组(M组)、Cathepsin B抑制剂(CBI)组、JNK抑制剂(JNKI)组。采用改良Longa线栓法制作大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)缺血再灌注的动物模型。模型组、CBI和JNKI干预组大鼠分别于缺血2小时后设七个再灌注时间点:0min、15min、30min、2h、6h、12h和24h。各大组之间的比较选择Cathepsin B、JNK、Bid三种蛋白表达峰值时间点进行比较。CBI组在模型复制前1h脑室灌注Cathepsin B抑制剂CA-074ME(10μg/5μl1%DMSO);JNKI组在模型复制前半小时侧脑室注入JNK抑制剂ZSP600125(30μg/5μl1%DMSO)。而假手术组和模型组分别给予5μl1%DMSO作为对照。采用TTC染色法观察及分析上述时间点脑组织缺血梗死情况;采用Tunel法检测受损脑组织细胞凋亡;采用Westernblot检测Cathepsin B、JNK和Bid等蛋白在脑缺血再灌注损伤时的表达水平;采用免疫共沉淀检测Cathepsin B、JNK和Bid的相互作用,用免疫荧光双标检测与分析Cathepsin B、JNK和Bid两两间蛋白表达的相关性和共定位关系。结果:1.TTC染色结果显示,缺血再灌注24小时后假手术组无明显的脑组织缺血梗死病灶,呈红色;而模型组可见明显的缺血梗死病灶,可见大片的缺血区域,呈苍白色,与假手术组相比较,具有显著统计学差异(P<0.001);与假手术组相比较,缺血再灌注24小时后CBI组和JNKI组均可见缺血区域,呈苍白色;而与模型组相比较,CBI组和JNKI组的梗死灶体积均明显减少,差异均具有显著统计学意义(P<0.001,P<0.001)。2.Tunel染色结果显示,假手术组脑组织内未见或仅见少量凋亡细胞,模型组的大脑缺血侧视前区,从缺血再灌注开始可见大量的凋亡细胞,且凋亡细胞随着再灌注时间延长而增加,再灌注12h达到顶峰,与假手术组相比较,模型组缺血再灌注时细胞凋亡显著增加,具有显著统计学差异(P<0.05),但模型组再灌注12h和24h凋亡指数相比无统计学差异。与模型组相比较,CBI组和JNKI组均可减少缺血再灌注24小时的凋亡细胞,且均具有统计学差异(P<0.05,P<0.05)。3.Western blot结果显示,与假手术组相比较,在缺血再灌注模型组的脑组织中Cathepsin B蛋白表达增加,且在15min和6h时出现两个时间点的表达高峰。在缺血再灌注模型组中,缺血再灌注30min即检测到JNK3蛋白表达增加,再灌注6h时JNK3蛋白表达至高峰水平,再灌注12h、24h开始呈下降趋势。模型组脑组织中Bid蛋白表达也明显增加,且其表达早于Cathepsin B蛋白,缺血再灌注15min时即可检测到Bid蛋白表达增多,再灌注2h时至高峰水平,随后逐渐下降。4.与模型组相比,在Cathepsin B、JNK3与Bid蛋白表达高峰相对应时间点,CBI组脑组织中Cathepsin B、JNK3与Bid蛋白表达均明显减少,差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。5.Western blot结果也显示,在Cathepsin B、JNK3与Bid蛋白表达高峰相对应时间点,与模型组相比较,JNKI组脑组织中JNK3蛋白表达增加受易抑制,具有统计学差异(P<0.05)。JNKI组中Cathepsin B和Bid蛋白表达增加也受到抑制,与模型组相比较,均具有统计学差异(P<0.05,P<0.05)。6.Cathepsin B与Bid免疫荧光双标结果显示,假手术组可见少量Cathepsin B与Bid表达,且两者主要共定位于同一神经元。与假手术组相比,缺血再灌注组模型组中,Cathepsin B与Bid蛋白共定位表达在再灌注6h显著增多。JNK3与Bid免疫荧光双标结果显示,在假手术组可见少量JNK3与Bid表达,且两者共定位于同一神经元,但缺血再灌注组模型组与假手术组相比,JNK3与Bid蛋白共定位表达且明显增多。进一步分别以Cathepsin B抗体与JNK3抗体为诱饵蛋白行免疫共沉淀,结果表明Cathepsin B与Bid、JNK3与Cathepsin B、JNK3与Bid之间存在共沉淀。结论:1.采用改良Longa线栓法可以成功复制MCA缺血再灌注模型。2.在缺血再灌注损伤过程中,可以观察到Cathepsin B、JNK3和Bid等蛋白表达增加,而采用Cathepsin B抑制剂CA-074ME和JNK抑制剂SP600125后,大脑缺血再灌注损伤减轻,细胞凋亡下降,大鼠神经功能得部分恢复,表明,Cathepsin B和JNK3参与脑组织缺血再灌注损伤的形成,Cathepsin B-JNK3-bid-溶酶体-Cathepsin B信号回路可能是细胞凋亡的新信号通路。3.免疫共沉淀和免疫荧光结果显示,Cathepsin B、JNK3和Bid三者存在相互作用。4.组织蛋白酶B抑制剂与JNK特异性抑制剂对组织蛋白酶B和JNK3蛋白均有抑制作用,对减少细胞凋亡和改善神经功能有重要作用。Cathepsin B-JNK3-bid-溶酶体-Cathepsin B信号回路可能是细胞凋亡的新信号通路。