人核糖核酸酶抑制因子(Human Ribonuclease Inhibitor, hRI)是分布在细胞浆中的一种酸性蛋白,分子量为50kDa。hRI是由15个亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat, LRR)组成的。它含有32个高度保守的半胱氨酸残基,这些半胱氨酸都是处于还原状态,这是其维持正常的生物学活性所必需的,这也决定了hRI只有在还原性的环境下如胞液中才能发挥其功能。hRI的三级结构呈对称的马蹄形结构。hRI能抑制胰脏来源的RNAaseA活性,hRI与RNaseA紧密结合形成1:1的复合物。hRI也是血管生成因子(Angiogenin,Ang)的高效抑制剂。人的RI基因定位于11号染色体(11p15.5)。 在癌症患者中,染色体11p15.5部位常常有变异, 因而RI可能与细胞的生长和分化相关。众所周知,新生血管形成是肿瘤持续生长和转移所必需的。所以抑制肿瘤血管的生长,成为肿瘤治疗的重要方法之一。血管生成因子在正常的或癌变的组织和细胞都有分布。血管生成因子作用于血管内皮细胞,促进血管内皮细胞增殖,具有强烈的诱发血管生成活性。hRI由于其与血管生成因子的特殊作用,使之成为一种比较有潜力的肿瘤治疗的药物。动物实验已逐渐证实,hRI具有抑制动物体内移植瘤生长的作用。本实验室从人胎盘中和猪肝中提取的RI,给予荷瘤小鼠后可以抑制乳腺癌实体瘤Ca761,肉瘤S180,肝癌实体瘤H22的生长。并通过实验证实恶性肿瘤患者红细胞中RI活性下降,瘤组织内的基因表达下降。 <WP=5>因为RI在肿瘤治疗中有较好的应用前景,并且RI从组织中提取的产量较少,成本高,不适宜大批量生产,所以本室一直研究其基因工程生产的方法。但是重组的RI在大肠杆菌中的表达后是以包含体的形式存在。包涵体是重组蛋白在菌体内过表达后形成的聚集体,但是其所含的重组蛋白没有生物学活性。这个问题一直困扰着我们,使我们的工作停步不前。本文主要研究了包含体的复性及纯化,为此作了以下的一些工作:1.hRI在 E.coli中的表达:用小量碱裂解法提取重组质粒pET23b-ri 并用氯化钙法转化表达菌BL21(DE3)。将BL21(DE3)置于含有氨苄青霉素的LB培养基中扩增至A600=0.6后加入诱导剂IPTG,诱导hRI的表达。2.包涵体的纯化和溶解:超声破碎细菌后,离心取沉淀,即包涵体。用含有去垢剂的缓冲液反复洗涤包涵体,以除去脂类、膜蛋白、黏附在其上的蛋白质。最后用含有8M的尿素和20mmol/Lβ-巯基乙醇的缓冲液将包涵体溶解。3.包涵体复性:本文采用了三种复性方法,分别是稀释法、凝胶过滤层析法、透析法。1)稀释法: 在稀释过程中尝试添加非离子型去垢剂TritonX-100来促进hRI的复性。并考察了复性条件:TritonX-100的浓度、初始蛋白浓度、复性时间。2)凝胶过滤层析法:采用Sephadex G-150层析柱,上样蛋白浓度1mg/L左右,上样量为0.4—0.8ml,流速为4—6ml/h。3)透析法:线性的从初始的4mol/L,以0.3mol/h的速度降低透析液中的尿素浓度,5h后停止。保持此尿素浓度(大约2.5mol/L)透析12h。继续线性的以0.3mol/h的速度降低透析液中的尿素浓度,7h后停止。4.亲和柱层析纯化:使用的配基为RNaseA。用缓冲液平衡亲和柱CNBr活化的Sepharose 4B,直至检测基线平稳。取复性后的样品上样。用缓冲液洗柱子,去除未结合的杂蛋白,直至基线稳定。用洗脱缓冲液洗脱柱子, 收集目标蛋白。 <WP=6>本文成功的使包涵体复性。发现在稀释中添加TritonX-100的浓度为0.05%,初始蛋白浓度为0.5mg/ml时复性效果比较好,相对复性率为12.3%;凝胶过滤层析法hRI相对复性率为10.7%;透析法hRI相对复性率为1%。复性后的蛋白质经RNaseA-Sepharose4B亲和柱层析纯化,纯度达95%左右。这些为RI基因工程方法生产奠定一定的实践基础。