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目的为了探究iNKT细胞在肥胖脂肪组织慢性炎症中的作用机制问题,(1)我们构建了小鼠肥胖脂肪组织慢性炎症模型,分析造模成功的相关指标及细胞因子的变化;(2)观察iNKT细胞在肥胖脂肪组织慢性炎症不同阶段脂肪及相关组织中的频率、亚群以及脂肪组织巨噬细胞频率和亚型的变化;(3)通过不同方式注射α-Galcer(100ng/g体重),观察肥胖改善效果;探讨iNKT细胞不同亚群的活化对巨噬细胞极化的影响,为肥胖相关疾病的治疗提供基础性研究数据。方法1.小鼠肥胖脂肪组织慢性炎症模型的构建4-5W雄性C57BL/6J小鼠高脂饲料分别喂养4W和12W,造模完成后以健康小鼠为对照,观察记录小鼠体重、精神状态、脏器形态和指数的变化;血糖仪检测小鼠GTT、ITT的改变;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察脂肪组织、肝脏炎性细胞的浸润及病理改变情况;微量样本多指标蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)检测肝脏和脂肪组织淋巴细胞刺激上清及血清中细胞因子水平的变化。2.小鼠肥胖脂肪组织慢性炎症不同阶段免疫功能状态研究流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测比较肥胖不同阶段脂肪及相关组织器官中CD4~+T、CD8~+T、iNKT细胞频率,iNKT1/iNKT2/iNKT10细胞亚群比例以及脂肪组织中巨噬细胞频率和亚型的变化;Western blot检测各组小鼠相关组织中T-bet、GATA-3、E4BP4、Arg-1、iNOS表达量的变化。3.腹腔和皮下注射α-Galcer干预小鼠肥胖脂肪组织慢性炎症的机制研究通过不同方式注射α-Galcer对肥胖模型小鼠进行干预。通过腹腔和皮下注射α-Galcer将动物进行分组,观察记录各组小鼠体重和精神状态以及GTT和ITT的变化情况;HE观察脂肪组织和肝脏病理情况的改变;FCM检测CD4~+T、CD8~+T、iNKT细胞频率、iNKT细胞亚群以及巨噬细胞频率、亚型的变化;CBA检测各组小鼠不同时期血清和脂肪组织以及肝脏淋巴细胞刺激上清中细胞因子的水平变化;WB检测各组小鼠肝脏和脂肪组织中相关蛋白的表达量差异;通过iNKT细胞与巨噬细胞共培养,FCM检测巨噬细胞亚型的极化。结果1.与健康对照组相比,模型组小鼠体重增长迅速(P<0.05),体型变大;高脂喂养4周后,小鼠的平均体质量未达到肥胖模型小鼠的体质量水平要求,而12周后,达到了肥胖水平要求;GTT和ITT检测发现模型组小鼠平均血糖水平一直处于较高水平,但并没有出现糖耐量受损和胰岛素抵抗;HE观察发现高脂喂养4周后,脂肪细胞体积增大,但炎性细胞浸润未见明显增多,而肝脏出现肝细胞脂肪变性,高脂喂养12周后,脂肪细胞体积不仅继续增大,而且炎性细胞浸润明显增多,以花环状围绕在脂肪细胞周围,肝脏开始出现脂肪肝以及大量肝细胞空泡,肝细胞脂肪变性更加严重;高脂喂养4周后,附睾旁脂肪组织形态以及脂肪指数均增大(P<0.05),造模12周后,模型组脂肪组织形态和脏器指数进一步增大(P<0.05);而高脂喂养4周和12周组脾脏和肝脏指数均无显著变化,但肝脏形态却发生了明显变化;高脂喂养4周和12周,血清和组织刺激上清中的炎性细胞因子水平均升高(P<0.05),且高脂喂养12周组血清中致炎性细胞因子TNF-α、IL-17A增多,而IL-6和IL-2却减少。2.除造模12周后脂肪组织中出现CD4~+T细胞的显著降低,其它时间点外周血和脂肪组织中CD4~+T、CD8~+T细胞基本都无显著变化;无论高脂喂养4周还是12周,模型组小鼠脂肪组织和肝脏中iNKT细胞频率都降低(p<0.05),而外周血、脾脏和胸腺iNKT细胞频率都无显著性差异,此外,高脂喂养12周组较4周组脂肪组织中iNKT细胞频率进一步降低,肝脏中却反而升高(p<0.05);高脂喂养4周胸腺iNKT1细胞频率增高,脂肪组织iNKT10亚群下降(p<0.05),高脂喂养12周胸腺、脾脏和脂肪组织iNKT1亚群比例都增高,而胸腺iNKT2、脂肪组织iNKT10亚群比例都下降(p<0.05);高脂喂养4周和12周后,模型组小鼠脂肪组织中巨噬细胞频率和M1亚群均增高(p<0.05),而M2亚群却下降(p<0.05),与高脂喂养4周组比较,高脂喂养12周脂肪组织巨噬细胞频率和M2亚群均无明显变化,但M1频率却升高(p<0.05);高脂喂养4周和12周后,脂肪组织E4BP4、Arg-1蛋白表达量均降低,iNOS蛋白表达量均增高,肝脏GATA-3表达量减少(p<0.05),且T-bet表达量升高(p<0.05)。3.腹腔注射α-Galcer能明显降低肥胖小鼠的体重并改善肝脏病理情况,而皮下注射α-Galcer则使小鼠体重呈现增加趋势,但能改善脂肪组织病理情况;两种α-Galcer注射方式对整体的葡萄糖耐量和胰岛素耐量曲线都没有明显的改善作用;腹腔注射α-Galcer可以增大脾脏体积和脾脏指数(P<0.05),并改善肝脏颜色和油腻感,而皮下注射α-Galcer对脂肪、脾脏和肝脏指数都无明显作用;腹腔注射α-Galcer使外周血、脾脏和脂肪组织iNKT细胞频率均增高(P<0.05),但对胸腺iNKT细胞频率却无影响,皮下注射α-Galcer只能激活脂肪组织iNKT细胞,并降低肝脏iNKT细胞频率,而对其它脏器的iNKT细胞无激活作用;腹腔注射α-Galcer主要激活脾脏和肝脏iNKT2亚群,而皮下注射α-Galcer主要激活胸腺iNKT2和脂肪组织iNKT10细胞亚群,并能提高脂肪组织中M2型巨噬细胞的比例以及降低巨噬细胞的频率(P<0.05);腹腔注射α-Galcer可以减少血清和肝脏刺激上清中致炎性细胞因子的分泌,并提高抑炎性细胞因子的分泌量,而皮下注射α-Galcer后却可以提高脂肪组织刺激上清中抑炎性细胞因子的水平,并降低炎性细胞因子的分泌;皮下注射α-Galcer使脂肪组织中E4BP4、Arg-1蛋白量明显增加,iNOS显著下降,而腹腔注射α-Galcer则能显著降低肝脏T-bet蛋白表达量并提高GATA-3的表达量;iNKT细胞与巨噬细胞共培养后,M2细胞亚群明显增多,而M1亚群比例显著减少,且共培养上清中抑炎性细胞因子显著增高,而致炎性细胞因子明显降低。结论1.高脂喂养4周,尽管体质量水平未达到肥胖要求,但炎性因子已增加;12周后,体质量达到肥胖标准,并且存在低水平的炎症状态。2.脂肪组织中iNKT细胞频率的减少,iNKT亚群失衡(iNKT1↑,iNKT10↓)可能参与了肥胖脂肪组织慢性炎症的发生。3.α-Galcer不同注射方式对不同组织中iNKT细胞亚群的激活存在差异。腹腔注射α-Galcer主要激活脾脏和肝脏iNKT2细胞亚群,而皮下注射α-Galcer主要激活胸腺iNKT2和脂肪组织iNKT10细胞亚群。4.皮下注射α-Galcer激活脂肪iNKT10细胞亚群引起M2巨噬细胞极化,改善了肥胖脂肪组织慢性炎症状态。5.腹腔注射α-Galcer激活肝脏iNKT2细胞亚群,有效改善了肥胖所致的肝细胞脂肪堆积。