【目的】本课题采用高脂饲料喂养制备小鼠非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型,动态观察NAFLD模型小鼠血清肝功能、血脂、炎症因子和肝脏组织中细胞色素b(Cytb)的表达特点;观察参苓健脾胃颗粒对NAFLD模型小鼠的治疗作用和炎症因子和肝脏Cytb影响作用。【方法】1.动物分组:雄性昆明种小鼠190只,随机分为2组,正常组50只和高脂模型组140只,6周末小鼠NAFLD模型复制成功后,高脂模型组随机分为4组,高脂模型组30只,参苓健脾胃颗粒颗粒低、中、高剂量组各30只。2.设置动态观察点:动态观察点分别为4周末,6周末,8周末,10周末,12周末,在4、6周末分别处死正常组和高脂模型组小鼠各10只取材,在8、10、12周末分别处死正常组、高脂模型组、参苓健脾胃颗粒低、中、高剂量组小鼠各10只取材。3.动物模型制备:用10%猪油+15%蔗糖+15%蛋黄粉+2.5%胆固醇+2.5%胆酸钠+0.2%丙硫氧嘧啶+54.8%基础饲料的高脂饲料制备NAFLD小鼠模型,分别从第4、6、8、10、12周末处死正常组和模型组各10只,观察小鼠NAFLD模型的动态变化和模型复制成功的时间点。4.灌胃给药:NAFLD模型构建成功后,给予相应治疗(7-12周),其中正常组和高脂模型组给予生理盐水灌胃(0.1m L·10g-1·d-1),参苓健脾胃颗粒颗粒低、中、高剂量组分别给予不同参苓健脾胃颗粒浓度的水溶液灌胃(0.1m L·10g-1·d-1),其中参苓健脾胃颗粒低剂量含药量0.13g·m L-1,参苓健脾胃颗粒中剂量含药量0.26g·m L-1,参苓健脾胃颗粒高剂量含药量0.52g·m L-1。5.病理检测:组织切片、HE染色动态观察4、6、8、10、12周末肝脏组织病理改变,显微镜观察并拍片。6.血清生化及肝组织指标检测:用全自动生化分析仪检测小鼠血清AST、ALT、TC、TG、LDL-C、HDL-C,ELISA法检测小鼠血清和肝脏TNF-α水平,荧光定量PCR法检测小鼠肝脏Cytb m RNA相对表达量,Western blotting检测小鼠肝脏Cytb相对表达水平。7.数据统计:采用SPSS22.0统计学软件,单因素方差分析实验结果。【结果】1.小鼠模型建立及动态变化:1.1小鼠肝脏组织形态学显示,4周末,高脂模型组出现少量细小的脂肪空泡,肝细胞轻微水肿,排列出现轻微紊乱,肝索可以辨认,无炎性因子浸润。6周末,高脂模型组出现大量细小的脂肪空泡,脂肪空泡面积占视野面积1/3,肝细胞胞质颜色轻微变浅,出现气球样变,细胞排列紊乱,肝索分辨不清,细胞核染色加深,出现少量炎性因子浸润,表明NAFLD小鼠模型复制成功。8-12周末,高脂模型组脂肪空泡不断增大,肝细胞胞质颜色变浅,细胞排列紊乱,肝索分辨不清,细胞核染色加深,炎性因子浸润逐渐增多。1.2小鼠血清生化指标显示,第4、6、8、10、12周末,同时间点比较,高脂模型组与正常组相比,血清AST、ALT、TC、TG、LDL-C、HDL-C均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。1.3小鼠TNF-α结果显示,第4、6、8、10、12周末,同时间点比较,高脂模型组与正常组相比,血清和肝脏TNF-α均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。1.4小鼠肝脏Cytb结果显示,第4、6、8、10、12周末,同时间点比较,高脂模型组与正常组相比,肝脏Cytb m RNA和Cytb相对表达量均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.参苓健脾胃颗粒疗效及部分机制:2.1小鼠肝脏组织形态学显示,8周末,与高脂模型组相比,参苓健脾胃颗粒各组小鼠肝脏组织病理改变有所减轻,其中参苓健脾胃颗粒高剂量组改变明显,具体表现为,脂肪空泡偶见,肝细胞排列清晰,肝索清晰,偶见炎性因子。10周末,与高脂模型组相比,参苓健脾胃颗粒各组小鼠肝脏组织病理改变有所减轻,其中参苓健脾胃颗粒高剂量组改变明显,具体表现为,脂肪空泡偶见,肝细胞排列清晰,肝索清晰,少量炎性因子浸润。12周末,与高脂模型组相比,参苓健脾胃颗粒各组小鼠肝脏组织病理改变有所减轻,其中参苓健脾胃颗粒高剂量组改变明显,具体表现为,脂肪空泡偶见,肝细胞胞浆疏松化,肝索不清晰,偶见炎性因子浸润。2.2小鼠血清生化指标显示,第8、10、12周末,同时间点比较,与高脂模型组相比,参苓健脾胃颗粒颗粒低、中、高剂量组血清AST、ALT、TC、TG、LDL-C、HDL-C均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.3小鼠TNF-α结果显示,第8、10、12周末,同时间点比较,与高脂模型组相比,参苓健脾胃颗粒低、中、高剂量组血清和肝脏TNF-α均降低,有统计学差异(P<0.05)。2.4小鼠肝脏Cytb结果显示,第8、10、12周末,同时间点比较,与高脂模型组相比,参苓健脾胃颗粒低、中、高剂量组Cytb m RNA相对表达量均有降低,第8周末,与高脂模型相比,参苓健脾胃颗粒低剂量组肝脏Cytb无统计学差异(P>0.05),第8周末,参苓健脾胃颗粒中、高剂量与高脂模型组相比,肝脏Cytb均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。第10、12周末,同时间点比较,与高脂模型组相比,参苓健脾胃颗粒低、中、高剂量组肝脏Cytb水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】1.本实验方法制备小鼠NAFLD模型在第6周末制备成功,在10-12周末表现由单纯性脂肪肝发展为脂肪性肝炎病变。2.TNF-α和肝脏Cytb在NAFLD的形成和发展过程中起到一定作用,随着NAFLD的进展,血清和肝脏TNF-α和肝脏Cytb水平升高。3.参苓健脾胃颗粒可清除肝内聚集的脂类物质,减轻NAFLD炎性反应,抑制和改善单纯性非酒精性脂肪肝向NASH发展,调节NAFLD线粒体氧化呼吸环境,保护肝细胞。