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酒精性肝病是长期无节制过度饮酒导致的肝脏损伤疾病,现已成为全球公共卫生问题之一。酒精性肝病以脂肪肝为典型代表,长期发展将导致肝炎、肝硬化甚至肝癌的发生,严重影响人们的生命健康。经大量科技人员的长期努力与实践,出现了多种治疗酒精性肝病的手段,其中临床上用得最多的是抗氧化剂等药物治疗及肝移植等非药物治疗,它们的出现给广大酒精性肝病患者带来了福音。然而,随着科学技术的不断发展及人们生活需求的不断提高,大多数治疗手段也慢慢地体现出其不足之处;因此,不断探索创新,寻找安全、高效、经济价值高的治疗手段已是现今广大研究人员共同努力的目标之一,同时也是时代发展的必然趋势。经大量研究发现,许多天然活性物质存在多种生物活性,其中多糖因安全、高效、低毒等优势已成为医学和食品等领域的热点关注对象。本课组在前期的实践中发现,桑葚果实中富含的多糖类化合物除具有已报道的抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳等活性外,还具有良好的体外乙醇脱氢酶活性,是潜在保护肝脏的天然活性物质,但其与抗酒精性肝损伤活性之间的关系尚不清楚,严重制约了桑葚多糖的深度开发利用。因此,对桑葚多糖进行深入研究,探究其与抗酒精性肝损伤活性之间的关系对保肝药物及相关保健食品的研发应用具有重要意义。为进一步探究桑葚多糖与抗酒精性肝损伤活性之间的关系,本课题组在前期研究的基础上,继续以桑葚多糖为研究对象,对其进行乙醇分级纯化,并从理化性质、结构表征、分子修饰、体外活性筛选及体内活性研究等方面开展桑葚多糖及其衍生物的抗酒精性肝损伤活性研究。但由于实验工作量、样品数量等客观因素,本研究主要选择低浓度乙醇分级纯化的方法对桑葚多糖进行分离纯化,并对其进行理化性质、结构表征、分子修饰研究,然后通过体外乙醇脱氢酶活性筛选,建立小鼠急性酒精性肝损伤模型,展开低浓度乙醇分级纯化下桑葚多糖及其衍生物的抗急性酒精性肝损伤活性研究,最后得到以下结果:1.利用热水浸提法及低浓度乙醇分级纯化(30%、50%,V/V)的方法从桑葚中获得2组分桑葚粗多糖(MFPA、MFPB),并通过DEAE-52纤维素层析法分别对MFPA及MFPB进一步分离纯化,最终获得4组分桑葚多糖(MFPA1、MFPA2、MFPB1及MFPB2),得率分别为13.78%、8.68%、9.79%与4.38%,经过苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法G-250法及硫酸-咔唑法的测定,MFPA1、MFPA2、MFPB1及MFPB2均含有少量蛋白质(0.73%、0.72%、1.29%、6.07%)和糖醛酸(3.92%、15.87%、6.11%、11.76%),其中,MFPA1与MFPB1主要为中性多糖,多糖含量分别为93.44%与89.68%,MFPA2与MFPB2主要为酸性多糖,多糖含量分别为70.56%与69.32%。2.采用高效凝胶色谱法对MFPA1、MFPA2、MFPB1及MFPB2的重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)进行测定并分析及纯度情况发现,其Mw分别为177 k Da、638 k Da、165 k Da和380 k Da,Mn分别为115 k Da、393 k Da、108 k Da和239 k Da,且色谱峰呈单峰,证实MFPA1、MFPA2、MFPB1与MFPB2为分子量均一的多糖,经高效液相色谱法测定后得知,MFPA1主要由Man、Rha、Glc和Xyl组成,MFPB1主要由Man、Rha、Gal A、Glc和Xyl组成,MFPA2与MFPB2主要由Man、Rha、Glc A、Gal A、Glc、Xyl和Arb组成;经紫外光谱及红外光谱鉴定后发现,MFPA1、MFPA2、MFPB1及MFPB2中仅含有少量蛋白质和核酸等杂质,其分子内含有吡喃糖环与β-糖苷键,均具有多糖的特征吸收峰,证实MFPA1、MFPA2、MFPB1与MFPB2为多糖类化合物。3.分别采用浓硫酸法与溶媒法对MFPA1、MFPA2、MFPB1及MFPB2进行硫酸化修饰与羧甲基化修饰后各得到4组分桑葚多糖衍生物,即S-MFPA1、SMFPA2、S-MFPB1、S-MFPB2与C-MFPA1、C-MFPA2、C-MFPB1、C-MFPB2,其得率分别为23.90%、21.25%、24.03%、18.17%与30.01%、28.93%、25.69%、18.55%,经红外光谱鉴定后,两类桑葚多糖衍生物均修饰成功,其中S-MFPA1、S-MFPA2、S-MFPB1与S-MFPB2的硫酸根含量分别为6.13%,12.18%,6.12%和5.95%,取代度分别为0.39、1.01、0.38和0.37,C-MFPA1、C-MFPA2、C-MFPB1与C-MFPB2的取代度分别为0.66、0.73、0.32和0.41。4.采用瓦勒-霍赫法测定对MFPA1、MFPA2、MFPB1、MFPB2、S-MFPA1、S-MFPA2、S-MFPB1、S-MFPB2、C-MFPA1、C-MFPA2、C-MFPB1及C-MFPB2进行体外乙醇脱氢酶活性筛选,结果发现MFPA1、MFPB1、S-MFPA1及S-MFPB1具有良好的体外乙醇脱氢酶活性,当样品浓度为5 mg·m L-1时,MFPA1、MFPB1、S-MFPA1及S-MFPB1对体外乙醇脱氢酶的激活率分别为68.51±0.32%、64.41±0.54%、56.90±1.37%与45.30±1.51%,其有可能是潜在的预防和治疗酒精性肝损伤的重要活性物质。5.为了进一步探究桑葚多糖对酒精性肝损伤的影响,本研究通过体外乙醇脱氢酶活性的筛选情况,以MFPA1、MFPB1、S-MFPA1及S-MFPB1为实验对象,通过对小鼠进行急性酒精性肝损伤模型的构建,并观察不同实验组小鼠的体重、肝脏指数、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)指标及小鼠肝组织病理切片情况,综合评价了MFPA1、MFPB1、S-MFPA1及S-MFPB1对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏的影响,结果表明,MFPA1、S-MFPA1、MFPB1和S-MFPB1均能有效增强机体的自由基清除能力,提高脂质过氧化水平,对急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏均具有不同程度的保护作用,其中MFPA1的效果最好,该组的小鼠肝脏指数为4.11±0.13%,小鼠血清ALT、AST活性及TG水平分别为33.14±0.47 U·L-1、33.74±0.86 U·L-1和3.15±0.12 mmol·L-1,小鼠肝脏的SOD、GSH-Px活性及MDA含量分别为117.38±0.90 U·m L-1、75.14±3.25 U·L-1和1.57±0.02 nmol·m L-1,这些指标与空白对照组及阳性药物对照组之间均无极显著性差异,经肝组织病理切片的观察,该组小鼠的肝细胞形态结构、完整度等最好,其与空白对照组和阳性药物相似,MFPA1是潜在的保护酒精性肝损伤的重要活性物质。本研究为桑葚多糖作为治疗急性酒精性肝损伤的潜在药物提供了重要的科学依据和应用价值。