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糖类是自然界中最丰富的有机分子,几乎所有的生物都能合成和代谢糖类化合物。糖类除了作为生物体主要的能量来源,还可以作为细胞结构分子参与多种重要的生命活动,比如细胞识别、细胞迁移、炎症反应以及细菌和病毒的感染等。糖与脂类、核酸和蛋白质并称为四大类生物分子,同时糖也能与脂类、多肽和蛋白质作用形成糖脂、糖肽和糖蛋白等糖缀合物。相比之下,糖类结构更为复杂,其体外合成是糖类结构与功能研究的有效方式。目前,糖类体外合成仍然存在着巨大的挑战,化学法与生物酶法是糖类体外合成的两种主要方式。化学合成法比较灵活,但选择性差,合成过程涉及繁琐的保护与去保护步骤,特殊糖苷键（β-糖苷键）的合成困难。生物酶法因其高选择性,已成为化学合成的有效替代方法,被用来合成多种寡糖、多糖和糖缀合物。糖基转移酶和糖苷酶是目前合成糖类的主要工具。糖基转移酶（glycosyltransferase,EC 2.4.x.y）在生物体内可以将活化的核苷酸化的糖基供体中的糖连接到蛋白、核酸和脂类等受体分子上。因其合成具有严格的立体和区位选择性,反应产物比较专一且效率高,受到广泛关注。但是由于核苷酸化的糖基供体的制备困难,成本较高等因素,导致糖基转移酶的实际应用也受到了一定程度的限制。目前核苷酸化糖基供体的合成主要是通过一釜多酶法来实现,减少了复杂的分离纯化过程,从而提高产率、降低成本。鼠李糖基转移酶（Rhamnosyltransferase,Rha-Ts,EC 2.4.1.159）作为一类典型的糖基转移酶,广泛的存在于细菌和植物中,能够催化鼠李糖基化合物的合成。但dTDP-鼠李糖（dTDP-Rha）供体结构复杂、纯化困难,具有β-Rha这个特殊的糖苷键,其制备困难,目前还没有商业化纯品,已经成为鼠李糖基化合物合成的瓶颈。本论文主要通过生物酶法来合成dTDP-Rha。本论文从 Saccharothrix syringae CGMCC 4.1716 的基因组（NZJNYO01000004.1）中挖掘出四个DNA序列,为预测的合成dTDP-Rha的基因,分别编码 Glc-1-P 胸苷转移酶（SsRmlA,WP 033428542.1,296 aa）、dTDP-D-Glc-4,6-脱水酶（SsRmlB,WP033429095.1,351 aa）、dTDP-4-酮-6-脱氧-D-Glc-3,5-差向异构酶（SsRmlC,WP 033434852.1,208 aa）和 dTDP-4-酮-L-Rha还原酶（SsRmlD,WP033429096.1,303 aa）。以 S.syringae CGMCC 4.1716 的基因组为模板,通过PCR合成该四种片段,连接到pET21b/pET22b中并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,最后通过镍离子亲和层析柱纯化出异源表达的四种蛋白。本论文通过分光光度计法间接测定了这四个重组酶的活性,通过孔雀石绿比色分析法检测OD630反应无机磷的生成来证明SsRmlA的活性,利用分光光度计法检测OD320反应酮基的生成来证明SsRmlB的活性,利用分光光度计法检测OD340反应NADPH的消耗来证明SsRmlC和SsRmlD的活性。随后通过分子筛凝胶过滤层析确定了这四个酶的活性状态,SsRmlA为四聚体,SsRmlB、SsRmlC和SsRmlD都是二聚体。通过对SsRmlA底物特异性的研究发现,以Glc-1-P、GlcNH2-1-P和GlcN3-1-P为糖基供体,以dTTP、dUTP和UTP为糖基受体,一共可以合成九种核苷二磷酸葡萄糖,分别为 dTDP-Glc、dTDP-GlcNH2、dTDP-GlcN3、dUDP-Glc、dUDP-GlcNH2、dUDP-GlcN3、UDP-Glc、UDP-GlcNH2、UDP-GlcN3;通过对 SsRmlA 酶学性质的研究以及反应条件的优化发现,SsRmlA对Gllc-1-P的Km值为117.30M,kcat值为3.46 s-1;SsRmlA对dTTP的km值为49.56 μM,kcat值为5.39 s-1。同时发现,金属离子对SsRmlA的影响较大,Zn2+、Mn2+、Ag+、Co2+能够将SsRmlA的活性提高两倍以上,Mg2+对SsRmlA的影响最为显著,能将SsRmlA的活性提高五倍。合成 dTDP-Glc 的最佳反应条件为:2 mM Glc-1-P,0.5 mM dTTP,1.3 mM Mg2+,pH 9.5,温度为37℃,时间为1.5 h,其最大转化率为93%。开展了一釜多酶法合成dNDP-Rhamnose的研究,以Glc-l-P为糖基供体,反应体系中加入SsRmlA、SsRmlB、SsRmlC和SsRmlD四种酶,一共可以合成dTDP-Rha和dUDP-Rha两种脱氧核苷二磷酸鼠李糖,其中dTDP-Rha以dTTP、为糖基受体,dUDP-Rha以dUTP为糖基受体。研究了酶量、底物浓度、Mg2+浓度、NADPH浓度、温度、pH、反应时间等对一釜酶法合成dTDP-Rha产量的影响。dTDP-Rha 和 dUDP-Rha 的最佳合成条件为:2μM SsRmlA/B/C/D,2 mM Glc-1-P,0.5 mM dTTP,1.3 mM Mg2+,1.5 mMNADPH,温度为 30℃,pH 8.5,时间为2 h。此条件下dTDP-Rha的最大转化率为65%,dUDP-Rha的最大转化率为46%。两种产物经过HPLC（CarboPacTM PA-100）和G10层析柱纯化,并经过MS和NMR技术鉴定了分子结构。其中,这是对dUDP-Rha的首次合。