论文部分内容阅读
目的:临床研究发现麻黄生品与蜜炙品功效迥异,生品胜在发汗解表,蜜炙品胜在止咳平喘。为了更科学的了解生、蜜麻黄的不同传统用途,应探讨其药效物质基础并阐明其炮制作用机制。本研究利用代谢组学技术结合多元统计手段,研究麻黄生品及蜜炙品中代谢产物的变化,并在此基础上寻找并鉴定差异性化合物;接着运用网络药理学方法从整体层面上探讨麻黄发挥止咳平喘的作用机制,寻找此过程中参与的靶点与信号转导通路,初步阐明麻黄的蜜炙炮制机制。方法:1麻黄生品及蜜炙品的化学成分含量测定比较及质量评价研究1.1基于HPLC指纹图谱和多成分含量测定的麻黄蜜炙前后生物碱类成分比较研究采用HPLC法测定麻黄中生物碱类成分,建立生/蜜麻黄特征指纹图谱;同时对麻黄中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和盐酸甲基麻黄碱进行含量测定的比较分析。1.2基于Box-Behnken法的麻黄总黄酮和总酚酸提取工艺及蜜炙前后含量比较研究采用酶标仪微量法测定麻黄中总黄酮和总酚酸含量,以其含量的“总评归一化值”为考察指标,运用Box-Benhnken响应面法优化提取工艺。接着以最佳工艺为提取条件对生、蜜麻黄中总黄酮和总酚酸进行含量测定的比较分析。1.3基于UPLC指纹图谱结合多元统计分析的麻黄蜜炙前后非生物碱类成分比较研究采用UPLC法测定麻黄中非挥发性成分的非生物碱类成分,建立生、蜜麻黄特征指纹图谱,结合多元统计方法对比评价生、蜜麻黄质量差异。2基于代谢组学技术解析麻黄蜜炙前后化学成分的变化2.1基于GC-MS结合多元统计分析解析麻黄蜜炙前后化学成分的变化水蒸气蒸馏法提取麻黄挥发油,柱前衍生化提取麻黄初生代谢产物,建立麻黄中挥发油成分和初生代谢产物的GC-MS检测方法。采用工作站定性数据库和保留指数辅助定性等方法进行生、蜜麻黄代谢产物的定性鉴别,接着结合多元统计手段对生、蜜麻黄进行差异性分析,筛选引起差异的特征性化合物,并进行蜜炙前后的含量对比分析。2.2基于UPLC-Q-TOF-MS结合多元统计分析解析麻黄蜜炙前后化学成分的变化采用液质联用技术主要测定麻黄中非挥发性化合物,结合对照品、文献研究及化合物裂解规律进行生、蜜麻黄代谢产物的定性鉴别,运用多元统计分析手段对生、蜜麻黄进行差异性分析,筛选引起差异的特征性化合物,并进行蜜炙前后的含量对比分析。3基于网络药理学的蜜麻黄止咳平喘作用机制初探以第二章中筛选得到的差异性化合物作为引起生、蜜麻黄差异的活性成分,利用网络数据库筛选出疾病和差异性成分的共同靶基因,采用R语言、cytoscape等软件对交集基因进行“成分-靶点-疾病”网络、蛋白互作网络的构建,接着进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,最后构建“成分-靶点-信号通路”网络图,初步阐述蜜麻黄的止咳平喘作用机制。结果:1.共标定生、蜜麻黄生物碱类特征指纹图谱13个共有峰,10批生、蜜麻黄相似度均大于0.90,各批次样品质量稳定。含量测定结果表示,各批次麻黄样品盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱之和均符合中国药典规定;蜜炙后,麻黄碱含量降低,具有统计学差异。2.Box-Behnken响应面法优选的最佳提取工艺为:超声时间12 min,提取浓度65%,液料比42:1(m L/g);运用最佳提取工艺的含量测定结果表示,麻黄经过蜜炙后,总黄酮和总酚酸含量均降低,差异具有显著性。3.共标定生、蜜麻黄非挥发性成分的非生物碱类特征指纹图谱25个共有峰,10批生、蜜麻黄相似度均大于0.80,各批次样品质量较稳定。基于25个共有峰成分,结合多元统计分析,生、蜜麻黄产生明显差异,进一步筛选得到7个差异性色谱峰,经蜜炙后,7个差异性化合物均显著降低。4.(1)基于GC-MS代谢组学研究,挥发油类成分和初生代谢产物分别定性鉴别41个、53个,共筛选差异性化合物15个、14个。蜜炙后,9种挥发性代谢产物含量显著升高,6种挥发性代谢产物含量显著降低;初生代谢产物新增4种,消失1种;其余产物含量显著增加。(2)基于LC-MS代谢组学研究,非挥发性代谢产物定性鉴别21个,共筛选差异性化合物8个。蜜炙后,差异性化合物含量均显著降低。5.网络药理学最终筛选得到7个核心差异性化合物,涉及38个关键靶点,参与调控20个信号转导通路。柠檬烯和α-松油烯通过作用核受体辅激活蛋白1(NCOA1)和核受体亚科3,C组,成员1(NR3C1)参与调控甲状腺激素信号通路(Thyroid hormone signaling pathway)和神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)的代谢过程可能与蜜麻黄止咳平喘作用增效有关。结论:本研究从挥发性和非挥发性化合物角度,采用基于代谢组学技术结合多元变量统计分析手段,全面、整体、宏观的对生、蜜麻黄代谢产物进行对比研究,筛选差异性化合物。同时运用网络药理学方法初步研究蜜麻黄止咳平喘作用增效机制,为后续深入阐释蜜麻黄炮制机制提供实验基础。