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本试验研究南洋楹的组织培养中的外植体植入,南洋楹不定芽初代培养、继代培养、不定芽伸长生长和继代苗生根诱导的主要影响因素,还初步进行了南洋楹组培苗移栽。为南洋楹组织培养技术进一步应用于生产提供依据。初步研究结果如下:
1.外植体植入的灭菌流程以2年生苗圃实生苗,南洋楹优树的幼嫩枝条的项芽和腋芽为材料,试验南洋楹外植体植入的灭菌流程。试验选用了①酒精(70%含有0.1%NaOH)+升汞(0.1%)②新洁尔灭(苯扎溴铵0.2%)+升汞(0.1%)⑨新洁尔灭(苯扎溴铵0.2%)+次氯酸钠(NaCl0.2%)三种灭菌剂组合进行了27种灭菌处理。新洁尔灭20min+0.1%升汞2min+2min,污染率死亡率最低,萌动率最高可达41.2%。
南洋楹外植体灭菌最佳流程:用洗洁精漂洗2~3min,自来水清洗4~5次,95%的酒精浸泡材料15sec,自来水冲洗2~3次。先用浓度为0.2%苯扎溴铵溶液浸泡灭菌20min,无菌水冲洗3次;把材料夹入有数滴吐温的无菌瓶中,加入0.1%升汞灭菌2min,无菌水冲洗3次;再把材料夹入另一个有数滴吐温的无菌瓶中,加入0.1%升汞灭菌2min,无菌水冲洗5次。
南洋楹外植体最好在上午和春季采集,灭菌成活率最高。非木质化茎段的灭菌效果明显优于半木质化茎段;而同是非木质化茎段的顶芽和腋芽灭菌效果差别不大。
2单因素诱导
对影响芽增殖的6-BA和NAA浓度、基本培养基、蔗糖浓度这几个因素进行梯度试验。
较高的6-BA浓度有利于南洋楹不定芽的增殖,当6-BA浓度为2.0 mg/L和3.0mg/L时芽倍增率差异不显著,在3.0 mg/L时芽倍增率最大达3.20。高浓度的NAA不利于芽的增殖,以低于0.5 mg/L为佳。MS基本培养基的芽倍增率明显高于DCR、WPM培养基。高浓度的蔗糖有利于芽增殖,当蔗糖浓度为30 g/L和40g/L时芽倍增率差异不显著,在40g/L时芽倍增率最大达3.53。选择MS基本培养基、6-BA浓度范围2.0 mg/L~3.0 mg/L,NAA浓度0.01 mg/L~0.5 mg/L,蔗糖浓度范围为30 g/L~40g/L来进行进一步正交设计试验。
3.初代培养
初代培养中,蔗糖、6-BA、NAA 3个因子对芽倍增率影响不显著,但其中蔗糖对芽增殖的影响最重要。试验中,蔗糖40 g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5mg/L+肌醇100 mg/L,pH=5.8。所得芽倍增率最大,达4.08。
4.继代培养
继代培养中,蔗糖、6-BA、NAA3个因子对芽倍增率影响不显著,但其中6-BA对芽增殖的影响最重要。试验中,Ms+蔗糖35 g/L+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+肌醇100mg/L,pH=5.8。所得芽倍增率最大,达3.38。
5.芽诱导伸长蔗糖和NAA两个因子对芽伸长影响不显著,而两者的交互作用对芽伸长影响显著。高浓度的蔗糖与低浓度的NAA联合有利于芽的伸长。当蔗糖30 mg/L+NAAOmg/L时,不定芽平均伸长长度最高达0.74cm。在同一配方中,芽伸长存在较大的个体差异。南洋楹不定芽伸长基本同时伴随根的生长。
6.生根培养
南洋楹的生根诱导中,蔗糖的影响不显著。NAA对根诱导影响显著,NAA的浓度以低于0.01mg/L为佳。蔗糖和NAA的交互作用对生根诱导影响极显著,当蔗糖30 g/L+NAA0 g/L时,南洋楹组培苗的生根率达62.5%。
7.苗圃培养
把高达2~3cm的南洋楹生根苗移栽到装有沙和基质的花盆中,置于塑料大棚中培育。30天后,移栽苗成活率为66.7%,生长状况良好。