草原兔尾鼠为啮齿目仓鼠科田鼠亚科兔尾鼠属，它是一种典型的草原荒漠鼠种。它的分布面积广，体型小，性成熟早，繁殖力强，种群密度高，终年活动，啃食牧草，频繁活动严重践踏植被，是新疆畜牧业发展的重要危害鼠种，严重影响着新疆畜牧业的发展。目前控制鼠害多采用传统的机械捕杀、化学毒杀等方法，但存在耗费大、专一性差、灭效短、种群恢复快等缺点，且化学毒杀方法对环境的危害较大。随着公众对环保和动物权益等意识的增强，许多国家开始转变鼠害防治策略，把免疫不育控制鼠害当作一项重要的研究内容。免疫不育技术在控制野生动物种群数量方面显示出诱人的前景，成为当前国际上一种很有潜力的种群控制技术。 哺乳动物卵透明带 (ZP)是由卵母细胞合成和分泌的，由ZP1、ZP2、ZP3三种硫酸化的糖蛋白组成，是精子在受精过程中必须穿过的障碍。其中ZP3有两个重要作用：一是ZP3上的寡聚糖链与精子专一性地结合；二是在与精子结合后诱导精子的顶体反应。大量实验证明，阻断精子与ZP3的结合就可以阻断小鼠、猪等哺乳动物的生殖过程。因此，ZP3是免疫不育控制有害动物种群和数量的理想靶抗原。 本研究利用实验室已经克隆到的草原兔尾鼠卵透明带3基因(lzp3)及昆明白小鼠卵透明带3基因(mzp3)开展一系列DNA疫苗免疫不育效果方面的研究，内容包括： 1.探讨不育疫苗的种属特异性为了探讨lzp3与mzp3对NIH小鼠抗生育的种属特异性，特选择草原兔尾鼠卵透明带3(lzp3)和昆明白小鼠卵透明带3(mzp3)基因构建四种DNA疫苗表达载体：pcDNA3-mzp3(pcD-M)、pcDNA3-lzp<,3>(pcD-L)、pcDNA3-aat-comp-mzp<,3>(pcD-ACM)和pcDNA3-aat-comp-lzp<,3>(pcD-ACL)。水动力转染技术取代传统的Hela细胞真核转染技术，用RT-PCR检测目的基因能够在小鼠肝脏中表达。上述DNA疫苗肌肉免疫NIH小鼠，ELISA分析表明重组质粒均能使小鼠激发较高水平的特异性抗体，且anti-LZP3能结合到小鼠卵透明带上(荧光结果)；抗生育结果表明四种DNA疫苗均具有免疫不育的效果，其中pcDNA3-aat-comp-mzp<,3>(pcD-ACM)的免疫效果最好；卵巢病理切片H．E染色结果显示pcD-M、pcD-L和pcD-ACL组卵巢结构没有变化，而pcD-ACM组卵巢结构发生病理性变化。结果初步说明草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3对NIH小白鼠均有抗生育效果，在不同小鼠科属和品系间ZP3不具有特异性。 2.HSP<,70>增强ZP3 DNA疫苗免疫效果为探讨分枝杆菌热休克蛋白(HSP<,70>)对草原兔尾鼠卵透明带3(lzp<,3>)抗生育效果，本实验设计带有连接子的融合引物，将HSP<,70>全长和C端分别与lzp<,3>融合构建重组质粒：pcDNA3-lzp<,3>-HSP<,70>(pcD-L-HSP<,70>)和pcDNA3-lzp<,3>-HSP<,70C>(pcD-LHSP<,70C>)。以具有抗生育功能的pcDNA3-lzp<,3>(pcD-L)和pcDNA<,3>-aat-comp-lzp<,3>-C3d3(pcD-ACLC)作为对照。水动力转染技术取代传统的Hela细胞真核转染技术，RT-PCR检测目的基因均能在小鼠肝脏中表达后，将其制成疫苗免疫NIH小鼠。T细胞增殖结果表明实验组均能刺激机体T细胞发生增殖，尤其是pcD-ACLC和 pcD-L-HSP<,70C>免疫组；ELISA分析表明重组质粒均能使小鼠激发特异性的LZP3抗体反应，且anti-Lzp3能结合到小鼠卵透明带上(荧光结果)；合笼结果显示除pcD-L-HSPTo免疫组外其它三种重组质粒均具有抗生育效果，其中pcD-ACLC和pcD-L-HSP<,70C>免疫组效果极显著，且未引发机体卵巢组织发生病理性变化。以上结果显示pcD-L-HSP<,70>和pcD-L-HSP<,70C>均可激发机体特异性的体液免疫和细胞免疫反应，但pcD-L-HSP<,70>未能显著性地增强NIH小鼠的抗生育效果：相比之下，pcD-L-HSP<,70C>能极显著地增强免疫不育效果。以上结果说明分枝杆菌热休克蛋白HSP<,70C>端比HSP<,70>全长具有更好的基因佐剂功效。 3.探讨壳聚糖介导ZP3 DNA疫苗口服免疫途径为探讨壳聚糖介导ZP3 DNA疫苗口服免疫途径的可行性，以壳聚糖分别包裹pcDNA3-lzp<,3>(pcD-L)和pcDNA<,3>-aat-comp-lzp<,3>-C3d3(pcD-ACLC)后口服免疫小鼠，同时以等剂量肌肉注射作为对照。水动力转染技术取代传统的Hela细胞真核转染技术，RT-PCR检测chitosan介导或未介导的目的基因均能在小鼠肝脏中表达。上述疫苗分别于0、3、6、9、12d快速口服免疫NIH小鼠，T细胞增殖检测表明口服和肌肉免疫组均能激发机体T细胞增殖，尤其是口服免疫组pcD-ACIC的增殖水平极显著高于对照组；ELISA检测结果表明口服免疫组血清中几乎不产生IgG和IgA，肌肉注射组相对产生较高水平的IgG，但是口服免疫组小鼠分泌物中含有高水平特异性的IgA；抗生育结果表明口服及肌肉免疫组均能引起小鼠平均窝崽数降低，但未达到显著性水平，且卵巢未发生病理性变化；直接免疫荧光结果表明在紫外激发光下不育小鼠卵透明带发出绿色荧光。以上结果初步表明快速口服壳聚糖介导的DNA不育疫苗pcD-L和pcD-ACIC均能降低小鼠的平均窝崽数，具有潜在的免疫不育功效。 4.抗生育免疫反应类型的确定为探讨不育疫苗可能的抗生育机制，采用IgG分型试剂盒的方法对DNA、protein、DNA-protein免疫鼠的抗血清进行IgG1和IgG2a分型检测。结果表明抗生育疫苗在具有很好免疫不育效果的同时，无论是DNA免疫还是protein免疫及DNA-protein免疫组IgG1/IgG2a均大于1，即免疫使小鼠机体激发体液为主的Th<,2>型免疫反应，大大减少了小鼠卵巢炎症或病理性变化发生的机率。