脊椎动物的晶状体是一种无血管、无神经分布的透明组织。晶状体的前端表面由单层上皮细胞所覆盖,而余下的绝大部分由无细胞核和无细胞器的纤维细胞组成。单层的晶状体上皮细胞终身保持有丝分裂的能力并负责维持晶状体的内稳定。晶状体上皮细胞分化为晶状体纤维细胞是一个伴随着细胞撤离细胞周期,降解自身细胞器和细胞核的过程。如果分化异常,将会导致白内障等疾病的发生。已有大量文献报道细胞分化过程受“类细胞凋亡通路”的调控。晶状体细胞的生长和分化受不同的生长因子调控(有些可能存在重叠),而且很多转录因子如,p53和c-Maf在维持晶状体上皮细胞的世系稳定和诱导纤维细胞的分化过程中扮演着多重角色。p53是一个肿瘤抑制因子,并在很多细胞的细胞凋亡途径中发挥着主要作用。p53的磷酸化和去磷酸化在维持其蛋白稳定和转录因子活性中发挥着重要作用。除此之外,p53还通过调节下游蛋白p21的表达参与细胞周期的调控。有研究报道p53敲除后将影响晶状体的发育,然而,p53在调控晶状体的发育和分化过程的分子机制仍不清楚。同时,磷酸化状态的p53在调控晶状体的发育和分化过程的作用也还不清楚。因此,我们通过以下三个水平的实验以检测p53在晶状体发育尤其是晶状体分化过程中的作用。1、我们首先检测p53的表达量和磷酸化水平在调节晶状体的发育尤其是分化过程中的作用；2、p53在晶状体发育和分化过程中与哪些蛋白分子存在相互联系；3、在晶状体发育和分化过程中哪些基因受到p53的转录调控?1.本论文中,我们首先利用免疫组织化学的方法检测了小鼠三个胚胎时期(E14.5,E17.5,E19.5)的晶状体中总p53和三个丝氨酸位点(Ser15, Ser20, Ser392)分别磷酸化的p53的表达模式。我们的研究结果表明,在小鼠胚胎晶状体发育过程中总的p53和p53在Ser15, Ser20, Ser392位点的磷酸化水平随着晶状体细胞分化进程的递进而升高。2.诱导小鼠晶状体上皮细胞α TN4-1分化并形成透镜状小体(lentoid body)与体内晶状体上皮细胞分化的表现形式相似。我们通过shRNA干扰和显性抑制(Dominant Negative)的方法下调α TN4-1中内源性p53的表达量后发现,α TN4-1的透镜状小体形成率也随之下降但细胞的生长速度和迁移率却未受到显著性的影响。3.我们证实了高浓度的bFGF(50-100ng/ml)可以诱导细胞分化,并利用高浓度bFGF诱导α TN4-1细胞分化。我们检测到走向分化的α TN4-1细胞中p53的Ser15和Ser20位点磷酸化水平升高,并伴随着p53的上游蛋白激酶ERK1/2和Chk1也升高。而且我们也发现p53的下游蛋白Bak(一种Bcl-2家族中促细胞凋亡因子)也随之升高。当RNA干扰p53后,bFGF诱导α TN4-1细胞的分化进程则受到显著性的抑制。4.我们再利用免疫组织化学的方法发现p53敲除小鼠胚胎发育过程中晶状体细胞中转录因子c-Maf,细胞周期抑制蛋白p21和晶状体分化标志蛋白αB-crystallin的表达量下降。5. α TN4-1透镜状小体形成过程中c-Maf的表达水平上升同时p53Ser20位点的磷酸化水平也有少量上升,而当利用RNA干扰内源性p53后,c-Maf的表达量则随之显著性下降。因此,我们推测p53可能调控c-Maf的基因转录。6.利用生物信息学技术我们预测到c-Maf基因中含有有两个保守的p53结合位点,并通过体外凝胶迁移滞后实验(EMSA)证实了我们的假设。并且荧光素酶活性检测的实验表明p53增强了c-Maf基因-584/+45区域的转录活性。7.我们发现p53敲除小鼠的晶状体中α A-crystallin的表达量比正常小鼠的要低。再次借助于生物信息学技术,我们也发现了α A-crystallin的基因中也含有p53的保守结合位点。于是我们构建了带有不同α A-crystallin基因片段的荧光素酶报告载体。通过荧光素酶活性检测的实验,我们发现p53可以提高α A-crystallin的基因转录活性。然后再利用体外EMSA的方法,我们证实了α A-crystallin的基因与p53存在相互作用,最后通过体内ChIP实验的结果表明,p53直接绑定到α A-crystallin启动子-621/-594区域保守的p53结合位点上,而内含子中的p53结合位点可能起到了增强子的作用,并共同调控α A-crystallin基因的转录水平。总结以上结果,我们得出如下结论：1、p53促进c-Maf和α A-crystallin基因的转录活性。并且,通过调控c-Maf和Crystallins的基因表达而调节晶状体的分化可能是p53调节晶状体分化的主要途径之一。2、晶状体细胞分化过程中,Ser20位点磷酸化的p53在细胞核和细胞质中都呈现了差异性的表达,提示这个位点在晶状体细胞分化过程中可能扮演重要角色。3、我们的研究为p53在细胞分化领域的研究提供了新的参考,同时也为眼科疾病尤其是白内障的预防和治疗提供理论依据。