研究背景：　　 肥胖是以过多的脂肪组织堆积为特点的，是心血管疾病、糖尿病、高血压病及癌症等多种疾病的高危因素。而目前认为脂肪组织不仅是甘油三酯最大的储存库，而且是人体的很重要的内分泌器官之一。据估计，脂肪组织内20％-30％的基因可以表达可分泌的蛋白，它们包括：前炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、脂联素、纤溶蛋白及其他类激素类蛋白如瘦素和抵抗素等，并把这些有生物活性的分子，统称为脂肪因子。色素上皮衍生因子(PEDF)是最近认定的脂肪因子之一。这些脂肪因子通过自分泌、旁分泌、内分泌的形式发挥生物学作用。脂肪组织通过这些脂肪因子在炎症、能量代谢、胰岛素敏感性等方面发挥很重要的作用。　　 PEDF是一个分子量为50千道尔顿的单体糖蛋白，是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员，含418个氨基酸，位于染色体17p13，但因缺少丝氨酸反应环而缺乏抑制蛋白水解酶的活性作用，最近被确定为是脂肪细胞分泌的脂肪因子之一。PEDF最早由Tombran-Tink等从人胎儿视网膜色素上皮细胞培养调理液中纯化分离出来，能诱导培养Y79视网膜母细胞瘤细胞的神经元分化，具有神经营养作用。PEDF由视网膜色素上皮细胞(RPE)旁分泌至视网膜感光细胞问基质，对视网膜的分化起重要作用。继而，PEDF被发现在血管生成、神经元分化、炎症及氧化应激中均起着很重要的作用。例如，在内皮细胞，PEDF抑制细胞的增殖、迁移、管型形成、诱导内皮细胞的凋亡；在肾小球系膜细胞，PEDF不影响细胞生长，但抑制系膜细胞的扩张和纤维化因子的表达；在巨噬细胞，PEDF抑制细胞的凋亡和阻碍巨噬细胞的活化。另外，PEDF促进脊髓运动神经元的生长和分化。　　 最近有报道在2型糖尿病病人的血浆PEDF水平明显增加，这一趋势与体重指数呈正相关；在代谢综合征的病人、1型糖尿病的病人或者健康对照者中血浆或血清水平的PEDF与体型肥胖是明显相关的。但是，PEDF的改变在这些肥胖相关的疾病中的作用还不清楚。因此，研究PEDF在脂肪生成和脂肪细胞生理中的作用，对于阐明PEDF和肥胖之间的潜在联系和机理，指导肥胖的治疗，控制心脑血管病的危险因素等有重要意义。　　 研究目的：　　 本研究以小鼠的3T3-L1细胞为脂肪细胞模型，探讨PEDF在3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中的作用及其机制。　　 方法：　　 1、3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化：3T3-L1细胞株购自ATCC，复苏后在含10％的小牛血清的改良Eagle培养基(DMEM)液中培养至95％-100％，接触抑制两天后用经典的激素鸡尾酒方案诱导细胞分化成成熟的脂肪细胞，直至细胞内出现带有花环型的成熟的脂滴环形排列，且分化成熟的细胞占总细胞数的95％以上。成熟的脂肪细胞中的脂滴可以用油红染色来鉴定。　　 2、免疫印迹法(Western-Blot)检测目标蛋白的表达：提取细胞总蛋白，通过Western-Blot分析检测脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、CCAAT-增强子结合蛋白α(CEBP/-α)、CCAAT-增强子结合蛋白β(CEBP/-β)、前脂肪细胞因子-1(Pref-1)、过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPAR-γ)、在苏氨酸202和酪氨酸204位点上磷酸化的丝裂原激活蛋白激酶(phospho-p42/44 MAPK at Thr202/Tyr204)、总的胞外信号调节激酶(total ERK)、苏氨酸180和酪氨酸182位点上磷酸化的p38(phospho-p38 at Thr180/Tyr182)、总p38(total p38)、在苏氨酸188位点上磷酸化的CCAAT-增强子结合蛋白β(phospho-C/EBP-β at Thr188)的蛋白表达水平。　　 3、实时荧光定量PCR：收集脂肪细胞提取总RNA，逆转录为cDNA，通过Real-timePCR检测前脂肪细胞因子-1(Pref-1)和PEDF的基因表达水平。　　 4、酶联免疫法(ELISA)检测前脂肪细胞和脂肪细胞中分泌的PEDF：分别收集前脂肪细胞和脂肪细胞的培养液，通过ELISA方法检测培养液中的PEDF水平。　　 5、细胞增殖计算：测量细胞DNA增殖的含量来分析细胞的增殖情况，荧光强度在荧光显微镜的激发波长为485nm，发射波长为530nm在荧光微板上读出。　　 6、统计学分析：所有的实验至少重复三次。数据以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验，三组或以上之间的比较采用ANOVA中的Bonferronis post hoc检验。当P值小于0.05时有统计学意义。　　 结果：　　 1、在前脂肪细胞开始分化的早期，加入生理浓度范围内的人PEDF能抑制脂肪细胞内脂滴形成，下调脂肪细胞标志蛋白脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)和激素敏感性脂肪酶(HSL)。　　 2、采用表达PEDF基因的腺病毒感染3T3-L1细胞方法，发现PEDF过表达同样能抑制脂肪细胞内脂滴形成及下调脂肪细胞内标志性蛋白的表达。但在前脂肪细胞开始分化的中期加入PEDF并没有抑制前脂肪细胞分化的作用。　　 3、在前脂肪细胞分化的早期，加入生理浓度范围内的PEDF能抑制主要的促进脂肪细胞生成的转录因子如CCAAT-增强子结合蛋白α(C/FBP-α)和过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPAR-γ)的蛋白表达，但是在前脂肪细胞分化的中期加入PEDF对C/EBP-α和PPAR-γ的蛋白表达无作用。　　 4、PEDF或者丝裂原激活蛋白激酶/胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)特异性的抑制物U0126能顺序性的抑制早期ERK的活化及诱导液诱导的细胞克隆性增生。而且，PEDF能在苏氨酸188位点上抑制CCAAT-增强子结合蛋白β(C/EBP-β)的磷酸化。　　 5、PEDF的mRNA水平在细胞开始分化的第一个24小时内明显减少，并且脂肪细胞分泌的PEDF较前脂肪细胞分泌的PEDF明显减少。　　 结论：　　 1、PEDF可能通过抑制前脂肪细胞的克隆性增生来抑制3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化，而且这种抑制作用只有在前脂肪细胞开始分化的早期才有作用。　　 2、PEDF抑制前脂肪细胞分化的机制可能与其阻断MAPK/ERK信号通路，抑制C/EBP-α和PPAR-γ的蛋白表达有关。