研究目的与背景下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)是一种恶性程度较高的头颈部鳞状细胞癌,约占头颈部鳞状细胞癌的5%-15%,其好发于下咽部梨状窝、下咽后壁及环后区,其中最常发生于下咽梨状窝区。下咽癌发病率虽然较低,但由于其早期症状隐匿,大部分患者发现时已处于中晚期,因此,被诊断出的下咽癌患者常发生淋巴结转移,部分患者甚至以颈部淋巴结肿大为首发症状。目前,随着包括手术、术前或术后放疗和化疗等的现代综合治疗技术的进步,早期下咽癌患者的5年生存期已可高达70%,但由于症状的隐匿性,大多数的下咽癌患者被发现时已处于中晚期,其5年生存期仅为35%左右,且晚期的下咽癌患者经治疗后仍容易复发。因此,寻找新的肿瘤诊断标志物和治疗靶点,以早期诊断下咽癌及改善患者临床预后显得尤为重要。近年来,环状RNA(circular RNA,circRNA)作为一种特殊类型的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA),其结构有别于传统线性RNA,具有闭合环状结构,且大量存在于真核转录组中,目前是RNA研究领域的热点。大多数的环状RNA由外显子序列构成,在不同的物种中具有高度的保守性,同时在不同物种组织及发育阶段中具有表达特异性。环状RNA因具有高度保守的环状结构,对核酶并不敏感,所以其比线性RNA更为稳定,使得环状RNA在作为新型临床诊断标志物和治疗靶点的开发应用前景上具有明显优势。此外,环状RNA在细胞内可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA),能竞争性结合miRNA,从而调控miRNA靶基因的表达。近几年来,越来越多的实验证据表明,环状RNA可以通过充当miRNA海绵、剪切或转录的调节因子和RNA结合蛋白来调控转录、剪切和基因表达过程。迄今为止,大量的circRNA已被证实在多种肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用,circRNA可以参与调节多种肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭、凋亡和药物抵抗等多种生物学功能,这些肿瘤包括:肝癌,胃癌,结肠癌,膀胱癌等。不同circRNA在多种肿瘤中的表达差异,表明了 circRNA可发挥促癌和抑癌的双重效应。因此,circRNA作为全新的肿瘤诊断标志物和潜在的治疗靶点,具有重要的临床应用前景。目前,circRNA在下咽癌中的生物学功能鲜有研究报道。本研究课题主要分为如下2个部分,(1)利用二代高通量circRNA测序技术来筛查下咽癌组织和癌旁正常组织中的circRNA表达差异,结果表明,相比于癌旁组织,多种circRNA在下咽癌组织中呈现明显高表达。因此,我们利用实时荧光定量PCR(quantitative-real time PCR,qRT-PCR)对数个在下咽癌组织中高表达的circRNA进行了验证,并通过预实验确定了 circMART3可能在下咽癌的发生发展中发挥着重要的作用,从而采用qRT-PCR进一步在50对下咽癌及其癌旁正常组织中对circMART3的表达量进行了检测,并分析了其表达水平与下咽癌患者的临床病理特点之间的相关性,并评估了 circMART3的表达高低与患者临床预后的关系。(2)通过利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术在体外构建了 circMART3沉默的细胞模型,且通过细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期和细胞transwell等实验研究了 circMART3对下咽癌生物学行为的影响。第一部分 环状RNA MART3在下咽癌中的表达水平及其相关临床意义研究目的筛查下咽癌组织与癌旁正常组织间的circRNAs表达差异,验证下咽癌组织中高表达的circRNA含量,检测50对下咽癌组织及其正常癌旁组织中的circMART3相对表达水平,并分析circMART3的表达水平与下咽癌患者临床特点和预后之间的联系。研究方法我们选取了2011年1月至2014年1月于山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉头颈外科经病理活检确诊为下咽鳞癌的55名患者作为研究对象,分别收集了 55名患者手术中的下咽癌组织和癌旁正常组织标本。其中5对样本利用CircRNA-Seq高通量测序检测了下咽癌组织及其癌旁正常组织中的circRNA表达谱,并分析了两组样本间的表达差异;并提取了另外50对下咽癌组织与癌旁正常组织的RNA,采用qRT-PCR的方法对高通量测序的结果进行了验证,并通过预实验确定了circMART3在下咽癌细胞中具有促进细胞增殖的功能,然后统计并分析了circMART3的表达水平与下咽癌患者临床病理特征及预后的关系。其中,利用Fisher精确检验或Chi-square检验来评估circMART3表达水平与患者临床病理特征,利用t检验来比较两实验组之间的差异,采用Kaplan-Meier法来绘制circMART3高表达或低表达组下咽癌患者的生存曲线,并利用Log-rank法来比较两组患者的生存率。研究结果1.与癌旁正常组织粘膜相比,有38条circRNAs在下咽癌组织中表达显著升高(P值<0.05,fold change>2),117条circRNAs在下咽癌组织中表达明显降低(P值<0.05,fold change>2)。2.选取2条在下咽癌组织中高表达的circRNAs(circMART3,circPTBP3)和2条在下咽癌组织中低表达的circRNAs(circPHF21A,circRSF1),利用qRT-PCR的方法在20对下咽癌组织和癌旁正常组织中对高通量测序结果进行了验证。qRT-PCR结果表明,circMART3和circPTBP3的相对表达量与高通量测序结果一致,并通过细胞增殖实验的预实验发现circMART3具有促进下咽癌细胞增殖的功能,而circPTBP3却不具有相应生物学功能;3.50对下咽癌组织的qRT-PCR结果表明,circMART3在下咽癌中的相对表达量为(1.4957±0.9913),其显著高于circMART3在癌旁正常组织中的相对表达量(1.0000±0.7325,P=0.0037)。且高表达circMART3的下咽癌患者具有更差的T分期(P=0.022),更早的淋巴结转移(P=0.038),以及更晚的临床分期(P=0.026)。此外,以circMART3相对表达水平中位数为界,将下咽癌患者分别分为低表达组和高表达组,我们发现circMART3高表达组患者的总体生存期显著低于低表达组患者(P=0.015)。研究结论1.circRNAs在下咽癌发生发展中具有重要的生物学效应,有望成为下咽癌新的诊断标志物和治疗靶点。2.我们首次发现circMART3在下咽癌组织中高表达,且circMART3的表达水平与下咽癌患者的T分期、淋巴结转移,临床分期以及总体生存率显著相关。因此,circMART3可能在下咽癌的发生发展中发挥重要的生物学功能,并可作为评估下咽癌临床预后的新的生物学指标。第二部分circMART3的验证及其对下咽癌细胞生物学功能的影响研究目的验证circMART3的环状结构及其特点,研究circMART3对下咽癌细胞增殖,周期,凋亡,迁移及侵袭等生物学行为的影响。研究方法利用设计好的反向引物(divergent primer)对从FaDu细胞提取逆转录来的cDNA进行PCR反应,相应扩增产物进行sanger测序,验证circMART3的碱基排列顺序。采取酶耐受实验验证circMART3的稳定性。采用siRNA转染下咽癌细胞株FaDu细胞,沉默circMART3,并利用qRT-PCR法检测circMART3在FaDu细胞中的相对表达量并评估敲除效率。利用CCK8实验检测circMART3对FaDu细胞的增殖能力的影响,采用Transwell实验来检测circMART3对FaDu细胞迁移和侵袭能力的影响,利用细胞流式仪来检测circMART3对FaDu细胞周期和凋亡的影响。研究结果Sanger测序结果显示,circMART3剪切位点及其序列正确,符合环状结构特点。酶耐受实验表明circMART3作为一种环状RNA,其分子结构稳定且能够耐受核糖核酸外切酶R(RibonucleaseR,RNase R)的酶切消化。qRT-PCR结果显示siRNA干扰后的FaDu细胞(si-circMART3)的circMART3表达水平显著低于对照组细胞(si-NC)。CCK8实验结果示,相比于对照组,低表达circMART3的FaDu细胞的增殖受到了明显抑制(P<0.05)。Transwell实验结果表明,降低circMART3的表达水平能够能够明显减弱FaDu细胞的迁移及侵袭能力。流式细胞仪检测circMART3对FaDu细胞周期及凋亡的影响,结果显示降低circMART3的表达对FaDu细胞各细胞周期无明显影响(P>0.05),但低表达circMART3的的FaDu细胞的凋亡比例却显著高于对照组细胞(P<0.05)。研究结论circMART3作为一种环状RNA,具有环状结构特点,且具有高度稳定性。circMART3能够促进下咽癌细胞的增殖,抑制其凋亡,且能够提高下咽癌细胞的迁移及侵袭能力。