论文部分内容阅读
目的:以非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)为主的肺癌是中国癌症患者的首要死因,由于肺癌的治疗手段较为局限,患者生存率较低,因此探索NSCLC的发病机制以期寻找新的分子靶点对于治疗NSCLC有重大意义。近年来,越来越多的研究表明KIAA1199和多种肿瘤的发生发展密切相关,但KIAA1199在NSCLC中的研究较少,其影响NSCLC的具体分子机制尚未明确。本研究旨在探讨KIAA1199在NSCLC中的作用以及其表达的调控机制。方法:(1)收集48例新鲜NSCLC组织及48例癌旁组织标本。(2)采用qRT-PCR法分别测定KIAA1199和miR-486-5p在NSCLC组织、癌旁组织和细胞株中的mRNA表达水平。(3)构建干扰和过表达KIAA1199的稳转细胞株,通过CCK-8法和克隆形成实验检测KIAA1199对细胞增殖能力的影响,通过Transwell和划痕实验检测KIAA1199对细胞迁移和侵袭的影响。(4)建立小鼠移植瘤模型在体内验证KIAA1199对于肿瘤细胞增殖的影响。(5)采用western blot法分析KIAA1199在NSCLC中蛋白表达水平以及其影响NSCLC发生发展所涉及的信号传导通路中关键蛋白的表达。(6)运用qRT-PCR和western blot法检测miR-486-5p对KIAA1199的mRNA和蛋白表达水平影响,根据TargetScan预测miR-486-5p和KIAA1199的结合位点,采用双荧光素酶报告系统验证KIAA1199能否与miR-486-5p靶向结合。(7)瞬时转染miR-486-5p模拟物或抑制剂后,通过CCK-8、克隆形成、Transwell和划痕实验检测miR-486-5p对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:(1)KIAA1199在NSCLC组织中表达较癌旁组织明显升高。(2)KIAA1199在6种NSCLC细胞株中的mRNA和蛋白表达水平均较正常人支气管上皮细胞株中表达水平显著升高,在其中选取A549和SPC-A1细胞株进行下一步实验。(3)在A549和SPC-A1细胞株中建立KIAA1199干扰和过表达稳转细胞株。抑制KIAA1199表达后,A549和SPC-A1细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著减弱。过表达KIAA1199后则可见A549和SPC-A1细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著增强。(4)在裸鼠皮下成瘤实验中,KIAA1199敲弱组的肿瘤体积及重量均较对照组显著减小。(5)过表达miR-486-5p能够显著下调KIAA1199的mRNA和蛋白表达水平,并抑制A549和SPC-A1细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(6)含野生型重组质粒的细胞内miR-486-5p能够与KIAA1199 mRNA的3’-UTR端特定位点靶向结合并显著降低相对荧光素酶活性,而含突变型重组质粒者相对荧光素酶活性无明显差异。(7)敲弱KIAA1199或过表达miR-486-5p后可见p-EGFR、EGFR、p-Src、p-Akt和p-Erk等蛋白表达下调,同时上皮-间质转化相关蛋白Snail、Slug、N-cadherin、Vimentin等表达亦下调。过表达KIAA1199 或抑制 miR-486-5p 表达后可见 p-EGFR、EGFR、p-Src、p-Akt 和 p-Erk 等蛋白表达上调,同时上皮-间质转化相关蛋白Snail、Slug、N-cadherin、Vimentin等表达亦上调。结论:KIAA1199在NSCLC中呈高表达,且受到miR-486-5p的负向调控。其表达下调后可通过影响EGFR信号传导,抑制下游Akt,Erk等信号通路的激活以及阻止上皮-间质转化,从而降低NSCLC的增殖、迁移和侵袭能力。