背景和目的:高脂质胆固醇血症是动脉血栓性疾病的高危因素之一,高脂质胆固醇能够明显增加患者动脉血栓的风险。一些回顾性及前瞻性的临床试验已经证明,脂质胆固醇与外周血细胞的关系密切,因此,对于脂质胆固醇对血细胞增殖、活化的调控机制方面的研究,有助于更好的明确骨髓增殖性疾病并发动脉血栓的危险因素,有助于更好的预防其动脉血栓产生。首先我们利用Lnk基因突变小鼠,对于脂质胆固醇促进血小板活化机制进行研究。其次,我们应用JAK2抑制剂TG101348,进一步对脂质胆固醇促进中性粒细胞、单核细胞增殖进行机制的研究。最后,脂质胆固醇对于巨噬细胞调控机制目前存在挑战,体内含量极少的过氧化低密度脂蛋白如何调节巨噬细胞对脂质胆固醇摄入,我们将对其进一步研究。通过上述三部分内容完善脂质胆固醇调控血细胞增殖活化介导动脉血栓形成的机制。方法:我们首先利用高胆固醇血症小鼠模型Ldlr^-/-小鼠建立Lnk^-/-→Ldlr^-/-小鼠模型,探讨脂质胆固醇是否能够与Lnk突变存在协同作用,对于血小板活性起到进一步促进作用及其具体机制。1.通过骨髓细胞移植方法建立Lnk^-/-→WT以及Lnk^-/-→Ldlr^-/-小鼠模型,与WT→WT,WT→Ldlr^-/-对照,并分别给予普通饮食以及高脂质胆固醇饮食喂养;2.比较4组小鼠血小板活性;3.构建富含胆固醇的脂质体,直接作用于血小板表面,比较血小板活性4.进一步分析脂质胆固醇对于血小板增殖活化通路的作用机制。其次,通过对WT小鼠及APOE^-/-小鼠进行JAK2抑制剂TG101348灌胃,进一步明确APOE^-/-小鼠模型中,高脂血症对中性粒细胞、单核细胞的促进作用及机制,同时明确JAK2抑制剂是否能够抑制高脂质胆固醇对于中性粒细胞、单核细胞的促进作用,进而降低其动脉血栓发生风险。1.对于接受高脂质胆固醇饮食的WT、APOE^-/-小鼠进行TG101348或者安慰剂灌胃30天,监测外周血中性粒细胞、单核细胞、血红蛋白、血小板数值,流式分析监测Ly 6c/g hi或者Ly 6c/g lo单核细胞数值;2.灌胃60天后,将小鼠安乐死后取外周血、骨髓及脾脏,测量脾脏大小,骨髓各类造血干细胞及前体细胞比例,及IL-3/GM-CSF下游通路蛋白磷酸化水平;3.灌胃60天后将小鼠安乐死,小鼠安乐死后取小鼠降主动脉进行油红O染色,测量脂质胆固醇在降动脉壁沉积的情况。最后,我们对于携带脂质胆固醇的天然低密度脂蛋白（nLDL）进行Alexa Fluor?488荧光染色标记,并与小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）在体外进行共孵育,探讨经修饰的LDL是否能够提高小鼠的BMDM对于天然LDL的摄取水平,同时对于经过共孵育的BMDM进行基因表达分析,从而探讨BMDM摄取LDL活化的潜在机制。1.分离WT、CD36^-/-、Ldlr^-/-小鼠骨髓细胞,通过细胞培养基筛选并培养WT小鼠BMDM;2.将WT、CD36^-/-、Ldlr^-/-小鼠的BMDM与携带荧光标记的nLDL、经修饰的LDL（oxLDL）共同孵育,在不同时间测量BMDM荧光强度;3.进一步收集与携带荧光标记的nLDL、oxLDL共孵育后的BMDM,提取mRNA,逆转录cDNA,通过RT-qPCR法测量相关基因表达情况;4.通过SREBF2 SiRNA敲除小鼠BMDM的SREBF2基因,而后通过RT-qPCR法测量相关基因表达情况。结果:实验1:1.高脂质胆固醇增加WT及Lnk^-/-小鼠血小板活性,表现为P-selectin表达、PKC表达的比例增高,Lnk^-/-小鼠的血小板活性明显高于WT小鼠;2.高脂质胆固醇增加WT及Lnk^-/-小鼠血小板AKT（PKB）磷酸化水平。Lnk^-/-小鼠中AKT（PKB）磷酸化水平增加明显高于WT小鼠;3.高脂质胆固醇降低WT及Lnk^-/-小鼠血小板SHIP1磷酸化水平实验2:1.小鼠经灌胃后,APOE^-/-小鼠中性粒细胞、单核细胞明显增加,TG101348能够降低APOE^-/-小鼠中性粒细胞、单核细胞数量,对于WT小鼠无影响;2.小鼠经灌胃后,APOE^-/-小鼠的造血干细胞增殖较WT小鼠明显增加,TG101348能够通过抑制p-ERK,p-STAT水平,降低APOE^-/-小鼠造血干细胞数量;3.小鼠经灌胃后,其降主动脉经由油红O染色,经TG101348灌胃的APOE^-/-高胆固醇饮食小鼠的脂质胆固醇沉积与安慰剂灌胃小鼠相比降低74%。实验3:1.OxLDL促进WT小鼠的BMDM对于nLDL的摄取,在48 h至72 h达到高峰,96 h之后逐渐下降;2.CD36^-/-、Ldlr^-/-小鼠的BMDM对于nLDL的摄取水平在加入与不加入oxLDL时无统计学意义;3.oxLDL与nLDL共同孵育48 h后,WT小鼠BMDM的IL-6和IL-1β的基因表达相对于单纯nLDL孵育明显升高,在CD36^-/-小鼠中,IL-6和IL-1β的基因表达无明显变化。在无nLDL的情况下,oxLDL的孵育并不能增加BMDM内IL-6和IL-1β的基因表达;4.在WT小鼠中,当oxLDL与nLDL共同孵育后,BMDM的Ldlr表达量相比于未加入oxLDL的BMDM有5倍¹0倍的提高,在CD36^-/-的小鼠中,Ldlr的表达量未见明显增高。当SREBF2转录被阻断后,oxLDL与nLDL共孵育时WT小鼠BMDM的Ldlr表达增高的现象被抑制。结论:1.在Lnk^-/-小鼠中,脂质胆固醇与Lnk^-/-产生协同作用,通过降低SHIP1蛋白活性增强AKT磷酸化水平,进一步增强血小板活性,增加动脉血栓发生风险;2.在APOE^-/-小鼠中,脂质胆固醇促进HSPC增殖,增加外周血中性粒细胞、单核细胞数量。JAK2抑制剂TG101348抑制IL-3/GM-CSF下游通路,降低APOE^-/-小鼠的HSPC水平,进而抑制APOE^-/-小鼠动脉血栓形成;3.oxLDL通过CD36,促进IL-1β及IL-6的表达;oxLDL促进巨噬细胞SREBP2增高,促进Ldlr表达促进小鼠巨噬细胞摄取nLDL,导致脂质胆固醇在巨噬细胞内聚集。