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Dlk1-Dio3基因簇非编码RNA,特别是长非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)的高水平表达对于诱导多能干细胞(inducedpluripotentstem,iPS)的全能性尤为重要。本研究选取此基因簇上3个重要lncRNAs(Gtl2、Rian和Mirg),通过原位杂交(ISH)和荧光原位杂交(FISH)技术对其在早期胚胎中的表达和亚细胞定位进行研究,通过亚硫酸氢盐测序分析两个主要的差异甲基化区(IG-DMR、Gtl2-DMR)在早期胚胎中的甲基化水平,另外通过甲基转移酶抑制药物5zaz-CdR处理TM3细胞体外分析lncRNAs的表达变化,以明确此基因簇lncRNAs在发育中的时空表达模式和表观调控机制,为进一步研究lncRNAs功能奠定基础。本研究首先建立了基于孔板和液滴操作的全胚胎原位杂交方法。其他实验结果如下:ISH结果显示,在发育的早期阶段(卵母细胞、1-细胞、2-细胞、4-8细胞期)检测不到Gtl2、Rian和Mirg的表达,而到桑椹胚阶段这些lncRNAs开始表达,并在囊胚期表达量更高,这3个lncRNAs的表达模式非常一致(这与本实验室通过qRT-PCR得到的结果一致);lncRNAs在囊胚都定位于内细胞团,而在滋养层中没有表达;FISH结果也进一步确认这3个lncRNAs在内细胞中的表达,而且在囊胚定位于细胞核外周。甲基化分析结果显示,在整个早期胚胎发育中,IG-DMR序列始终呈现父本染色体甲基化、母本染色体非甲基化状态,而Gtl2-DMR在父、母本染色体上都呈现非甲基化状态。体外5-aza-CdR处理TM3细胞,发现lncRNA的表达不受差异甲基化区甲基化调控。本研究首次明确了Dlk1-Dio3基因簇重要lncRNAs在小鼠早期胚胎发育过程的时空表达模式以及囊胚亚细胞定位,提示这些lncRNAs可能与胚胎干细胞的形成和维持存在内在联系,首次分析了IG-DMR、Gtl2-DMR在早期胚胎的甲基化模式,暗示DMR对lncRNAs的起始表达没有调控作用,而这两个DMR更可能是维持lncRNAs印记表达的主要因素。