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本文从以下几个部分展开论述: 第一部分 黄芩苷改善压力超负荷诱导的小鼠心功能异常及心肌肥厚 目的:研究黄芩苷对压力超负荷诱导的小鼠心功能不全及心肌肥厚的影响。 方法:本研究以8周龄的野生型雄性C57BL/6J小鼠作为实验对象,通过主动脉缩窄(TAC)构建心肌肥厚动物模型。手术前将体重相近的小鼠随机分为4组(每组n=10):假手术组(Sham+安慰剂),假手术+黄芩苷组(Sham+黄芩苷),主动脉缩窄组(TAC+安慰剂),和主动脉缩窄+黄芩苷组(TAC+黄芩苷)。于手术后4周行小动物心脏超声检查,随后于麻醉状态下留取心脏标本,一部分标本用多聚甲醛固定后用于组织学检测,一部分标本冻存于﹣80℃冰箱用于实时荧光定量PCR检测。同时称量体重、心脏重量、肺脏重量和胫骨长度用于评估心脏大小和肺淤血状况。另有体重相近的小鼠随机分为2组(每组n=18):主动脉缩窄组(TAC+安慰剂)和主动脉缩窄+黄芩苷组(TAC+黄芩苷)。于术后每日观察小鼠存活状况,用于生存分析,评估黄芩苷对负荷状态下小鼠生存率的影响。本研究的给药途径为灌胃(黄芩苷100mg/kg体重)。 结果:与假手术组相比,主动脉缩窄组小鼠心功能明显下降,具体表现在左室舒张末期内径(LVEDD),左室收缩末期内径(LVESD)和室间隔厚度(IVS)显著升高,而左室短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)明显下降。与主动脉缩窄组相比,主动脉缩窄+黄芩苷组小鼠上述指标均有所改善。主动脉缩窄组小鼠的心重/体重比、肺重/体重比、心重/胫骨长度比、心肌细胞横截面积明显高于假手术组小鼠;而主动脉缩窄+黄芩苷组小鼠上述指标均有所改善。实时荧光定量PCR检测结果显示,主动脉缩窄组小鼠心脏的胚胎基因(A型钠尿肽,ANP;B型钠尿肽,BNP;和β肌球蛋白重链,β-MHC)的表达水平明显升高,而黄芩苷干预组ANP和β-MHC的表达水平明显降低。生存分析结果显示,主动脉缩窄+黄芩苷组小鼠较主动脉缩窄组小鼠,术后生存率明显升高。 结论:黄芩苷明显改善压力超负荷诱导的小鼠心功能不全和心肌肥厚;黄芩苷可使压力超负荷诱导的小鼠心脏胚胎基因表达水平降低;黄芩苷能改善主动脉缩窄模型小鼠的生存率。 第二部分 黄芩苷减轻压力超负荷诱导的小鼠心肌纤维化、心肌细胞凋亡 目的:研究黄芩苷对压力超负荷诱导的小鼠心肌纤维化和心肌细胞凋亡的影响。 方法:购买8周龄的野生型雄性C57BL/6J小鼠为实验对象,通过TAC建立压力超负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型。实验分组及干预方法同第一部分。于手术后4周,各组实验动物于麻醉状态下留取心脏标本,一部分标本用多聚甲醛固定后用于组织学检测,一部分标本冻存于﹣80℃冰箱用于实时荧光定量PCR和Western blot检测。通过马松三色染(Masson trichrome stain)进行形态学检测,并拍照用于心肌纤维化程度的评估,采用实时荧光定量PCR进行纤维化的分子标志基因的检测。通过末端标记法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL)进行心肌组织凋亡信号的检测,并拍照用于凋亡程度的评估。通过Western blot检测与心肌细胞凋亡相关的Bcl-2家族成员Bcl-2和Bax的蛋白表达水平,用于进一步评估各组心肌组织的凋亡水平。 结果:与假手术组相比,主动脉缩窄组小鼠心肌纤维化水平和心肌细胞凋亡水平明显升高。与主动脉缩窄组相比,主动脉缩窄+黄芩苷组小鼠心肌纤维化水平有所改善,具体表现在Masson染色结果形态学的改善、量化的左室胶原容积分数的降低、和纤维化标志基因(I型胶原蛋白,collagenⅠα;Ⅲ型胶原蛋白,collagenⅢα,和结缔组织生长因子,CTGF)表达水平的降低。同时,主动脉缩窄+黄芩苷组与主动脉缩窄组相比,心肌细胞凋亡水平有所降低。具体表现在TUNEL阳性细胞所占的比例减少、促凋亡的Bax蛋白水平降低、抗凋亡的Bcl-2蛋白水平升高、和Bax/Bcl-2比值的降低。 结论:黄芩苷明显改善压力超负荷诱导的小鼠心肌纤维化,降低心肌纤维化标志基因的表达。黄芩苷明显减少压力超负荷诱导的小鼠心肌细胞凋亡,降低Bax/Bcl-2比值。 第三部分 黄芩苷改善压力超负荷诱导的心肌能量代谢异常 目的:研究黄芩苷对压力超负荷诱导的小鼠心肌能量代谢异常的影响,并进一步研究经口长期给予黄芩苷干预是否具有心脏脂毒性。 方法:购买8周龄的野生型雄性C57BL/6J小鼠作为实验对象,通过TAC构建压力超负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型。实验分组及干预方法同第一部分。于手术后4周,将各组实验动物于麻醉状态下留取心脏标本,标本冻存于﹣80℃冰箱用于实时荧光定量PCR和Western blot检测。荧光实时定量PCR用于检测参与葡萄糖和脂肪酸代谢的酶和过氧化物增生物激活受体(Peroxisome Proliferator Activatived Receptors,PPARs)的基因表达水平,Western blot用于检测PPARα和PPARβ/δ的蛋白表达水平。体外实验在大鼠H9C2心肌细胞中进行,分别用DMSO和去氧肾上腺素(PE)刺激细胞,48h后收取心肌细胞样品进行免疫细胞化学染色测量心肌细胞表面积、实时荧光定量PCR检测胚胎基因的表达、和Western blot检测ANP、PPARα和PPARβ/δ的蛋白水平。另将体重相近的雄性C57BL/6J随机分为4组(每组n=5):普通饮食组(SD+安慰剂),普通饮食+黄芩苷组(SD+黄芩苷),高脂饮食组(HFD+安慰剂),高脂饮食+黄芩苷组(HFD+黄芩苷)。于实验开始4周后,各组实验动物于麻醉状态下留取心脏标本,标本冻存于﹣80℃冰箱用于冰冻切片油红O染色和实时荧光定量PCR检测。 结果:持续4周的压力超负荷引起心肌组织参与葡萄糖代谢的酶(己糖激酶1,HK1;葡萄糖转运体1,GLUT1)的表达水平升高,而黄芩苷没有引起上述两个基因表达的进一步变化。同时压力超负荷引起心肌组织参与脂肪酸代谢的酶(肉碱脂酰转移酶1,CPT1α;中链脂酰辅酶A脱氢酶,MCAD;长链脂酰辅酶A脱氢酶,LCAD;二酰甘油酰基转移酶2,DGAT2)的表达水平下降,而黄芩苷干预使得上述基因表达回升。我们进一步检测了脂肪酸代谢基因的上游核受体PPARα和PPARβ/δ的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,模型组小鼠心肌PPARα和PPARβ/δ的表达均明显下降,黄芩苷干预后上调了PPARα和PPARβ/δ的表达水平。体外细胞实验结果显示,黄芩苷能减轻PE诱导的心肌细胞肥大,同时能够刺激PPARα和PPARβ/δ的表达。持续4周的黄芩苷干预没有引起高脂饮食喂养下的小鼠心脏过度堆积脂肪,进一步实时荧光定量PCR实验结果表明,高脂饮食上调CPT1α,MCAD,LCAD,和DGAT2的mRNA水平,而黄芩苷并没有使上述基因的mRNA水平进一步升高。 结论:持续4周的压力超负荷引起心肌组织葡萄糖代谢基因表达上调,而脂肪酸代谢基因下调;黄芩苷干预不能改变葡萄糖代谢基因的表达水平,却能够上调脂肪酸代谢基因的表达水平。PPARα和PPARβ/δ是调节脂肪酸代谢的重要的核因子,体内和体外实验均证实黄芩苷能刺激PPARα和PPARβ/δ的表达水平,进而增加脂肪酸代谢基因的mRNA水平。进一步的动物实验证实,持续4周的经口黄芩苷干预并不能引起明显的心脏毒性。