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研究背景平滑肌(SMC)广泛分布于人体的消化、呼吸、循环、泌尿和生殖等系统。平滑肌细胞是一类高度分化的细胞,可通过收缩产生张力使器官发生运动和变形,也可产生连续收缩和紧张性收缩,使器官对抗所承载负荷从而保持原有形状。平滑肌在心血管系统中主要参与血管的形成、血压的维持等生理过程,以及高血压、动脉粥样硬化等病理过程。近年来,心血管疾病患病率逐年升高,心血管疾病已经成为第一致死原因。高血压和动脉粥样硬化两种病理改变是引起心血管疾病的主要原因,而高血压和动脉粥样硬化都与平滑肌的功能、分化及增殖有密不可分的联系。因此,研究平滑肌的分化机制,对于控制心血管疾病的发生发展具有重要意义。GPM6B属于蛋白脂质蛋白(PLP)家族的跨膜蛋白,GPM6B最初在脊椎动物胚胎的神经系统中作为一种结构蛋白发现。以往研究表明GPM6B可以在中枢神经系统中发挥促进突触生成、调节血清素转运体(SERT)功能等作用。GPM6B不但在中枢神经系统发挥重要作用,在外周组织中如心脏、平滑肌、肝脏、骨骼肌、肾脏及脾脏都有所表达。GPM6B可调节肿瘤细胞的微管系统,GPM6B还会影响成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)的活性和细胞外基质的矿化作用,而且还和actin细胞骨架和基质小泡的出胞作用密切相关。在肿瘤学的研究中,发现GPM6B与肿瘤的新生血管密切相关,但GPM6B在心血管方面的作用目前还不清楚。高度分化的平滑肌细胞表达多种收缩和收缩相关蛋白,如smooth muscleα-actin(α-SMA),smooth muscle myosin heavy chain(MYH11)和calponin。多种理化因素如生长因子、炎症调控因子和剪切力等都可能调控平滑肌细胞的分化。其中,转化生长因子β超家族(TGF-βsuperfamily)中的TGF-β可诱导平滑肌标记基因在C3H10T1/2(10T1/2)细胞、神经嵴Mone-1细胞、间充质细胞和胚胎干细胞等多种多潜能干细胞中表达。TGF-β是一种多功能的细胞因子,调节包括增殖分化在内的多种细胞活动。TGF-β1通过Ⅰ型和Ⅱ型受体磷酸化Smad2和Smad3蛋白而使之激活,磷酸化的Smad2和Smad3与细胞内的Smad4蛋白结合形成复合物,转位至细胞核内与其他转录因子结合或单独调节目的基因的表达,从而影响细胞骨架和外基质。此功能与GPM6B对细胞骨架和外基质的作用高度重合,因此我们猜测,GPM6B可能通过调节TGF-β通路来调控平滑肌细胞的分化,从而影响了血管新生等病理生理过程。本课题将进一步探讨GPM6B与平滑肌细胞分化的关系。研究目的1探讨GPM6B在平滑肌细胞及组织中的表达情况。2明确GPM6B在平滑肌细胞分化过程中的作用。3阐明GPM6B调控平滑肌细胞分化的分子机制。研究方法1用TGF-β1诱导C3H10T1/2细胞向平滑肌细胞分化,并用分子生物学方法观察平滑肌细胞标记蛋白SM-MHC、α-SMA和Calponin,以及GPM6B的表达。2包装携带GPM6B shRNA的慢病毒并感染C3H10T1/2细胞,制作稳转细胞系sh-GPM6B1-5,并用包含无序质粒shRNA片段的sh-Scramble作为空白对照。用sh-GPM6B和sh-Scramble分别诱导分化C3H10T1/2细胞,观察GPM6B敲低后对C3H10T1/2细胞向平滑肌细胞分化的影响。3用TGF-β孵育稳转细胞系sh-GPM6B,观察GPM6B敲低后对TGF-β-Smad2/3通路和核转位的调控作用。4用TGF-β受体I(TβRI)的特异性激动剂SRI-011381和TGF-β共同孵育sh-GPM6B和sh-Scramble细胞系,观察敲低GPM6B对平滑肌细胞分化和TGF-β-Smad2/3通路的作用能否被TβRI特异性激动剂恢复。5在12.5天小鼠胚胎胸部和成年小鼠主动脉和小肠切片中,用免疫荧光方法标记GPM6B和p-Smad2/3,观察在体组织中发育过程中和成体组织中平滑肌细胞的GPM6B表达和Smad2/3磷酸化水平。6在诱导向平滑肌分化3天后的C3H10T1/2细胞中检测TβRI和TβRII的表达量,并通过免疫共沉淀技术检测分化细胞中与GPM6B直接结合的TGF-β-Smad2/3通路相关蛋白。研究结果1 GPM6B在平滑肌细胞分化过程中表达量逐渐升高,在小鼠胚胎平滑肌细胞分化过程中GPM6B处于高表达状态,而在成体平滑肌细胞中表达量处于较低水平。2敲低GPM6B的表达使诱导C3H10T1/2细胞向平滑肌细胞过程中平滑肌细胞特异性蛋白SM-MHC、α-SMA和CALPONIN的表达量降低,表明干涉GPM6B表达会抑制平滑肌细胞的分化。3敲低GPM6B的表达使TGF-β-Smad2/3通路中Smad2/3的磷酸化和核转位受到抑制,表明干涉GPM6B表达会抑制TGF-β-Smad2/3通路的激活。4用TGF-β1和TGF-β-Smad2/3通路的特异性激动剂SRI-011381共同处理细胞,会恢复干涉GPM6B表达后对平滑肌细胞的分化和TGF-β-Smad2/3通路激活的抑制作用,表明GPM6B通过调节TGF-β-Smad2/3通路而发挥调控平滑肌细胞分化的作用。5敲低GPM6B的表达不影响TβRI和TβRII的表达量,免疫共沉淀技术检测发现GPM6B在分化后的C3H10T1/2细胞中与TβRI直接结合,而不与TβRII或Smad2/3直接结合,表明GPM6B通过与TβRI直接作用而发挥对TGF-β-Smad2/3通路的调节作用。结论GPM6B可以与TβRI直接结合,激活TGF-β-Smad2/3通路,从而促进平滑肌细胞的分化,为调节平滑肌细胞分化和心血管再生的药物研发和治疗策略提供新的思路和靶点。