狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)感染中枢神经系统而引起的一种烈性人兽共患传染病。感染狂犬病病毒并出现临床症状的人或动物几乎百分之百死亡。预防和治疗狂犬病成为近几十年的重要课题之一,目前狂犬病以预防为主,而在治疗方面成效寥寥。病毒是一种专性细胞寄生生物,其依赖生物体复制和传播,因此,探讨狂犬病病毒与细胞的生物互作尤为重要。自噬,作为一种细胞自我保护性机制,进化上高度保守,广泛存在于真核生物,其主要功能是将细胞内生物大分子及损坏的细胞器在溶酶体内消化分解后供生物体重新利用,与凋亡、坏死一起称为三大细胞死亡机制。自噬按其功能分为大自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。自噬和病毒关系的研究近些年报道较多,有些病毒具备了逃逸宿主细胞自噬的功能,有些病毒在长期的进化中学会了如何利用细胞自噬来促进自身转录与复制。弹状病毒科的其他成员:水疱性口炎病毒(VSV),出血性败血症病毒(VHSV)和鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够诱导细胞自噬,但对于狂犬病病毒与细胞自噬关系的研究目前尚未报道,本研究从以下几个方面对狂犬病毒与细胞自噬的关系进行探讨。一、狂犬病病毒的感染诱导SK和NA细胞发生自噬。为了明确狂犬病病毒是否能够诱导细胞自噬,我们选择生物学特性截然不同的两株狂犬病病毒:强毒株GD-SH-01和弱毒株HEP-Flury病毒,通过对两株病毒感染SK和NA细胞后的western-blot检测,电镜观察以及转染GFP-LC3B质粒后观察GFP荧光点分布的方法,我们最终确定狂犬病病毒强毒株GD-SH-01株病毒可以诱导明显的细胞自噬,而弱毒株的自噬水平与未感染狂犬病病毒的空白细胞组相似。以上实验结果证明细胞自噬的诱导是病毒株特异的。自噬诱导差异是否与强弱毒株特性相关还有待探讨。二、狂犬病病毒诱导的细胞自噬与凋亡的关系。细胞自噬作为一把双刃剑,既是一种细胞保护性机制又可以诱导细胞走向死亡。细胞自噬和细胞凋亡同为细胞程序性死亡,其相关研究已有很多报道,主要概括为合作关系、对抗关系及推动关系。我们的实验结果证明狂犬病病毒强毒株GD-SH-01可以同时诱导细胞自噬和凋亡,接着我们探讨了狂犬病病毒诱导的细胞自噬和凋亡的关系。我们通过增强其中一种现象来看另一种发生的变化的方法来进行研究,结果显示在加入自噬增强剂的细胞组狂犬病病毒诱导的细胞凋亡现象明显弱于未加药物组,这个现象说明GD-SH-01诱导的细胞自噬是作为一种细胞保护性机制来消除病毒诱导的细胞凋亡这种不利细胞存活的生物学过程。三、GD-SH-01的M基因对自噬的影响。狂犬病病毒的基因组由5个结构蛋白构成:N,P,M,G,L,那么究竟是哪个基因在狂犬病病毒诱导细胞自噬方面起到最关键的作用呢,我们实验室通过将GD-SH-01的单个结构蛋白基因与相对应HEP-Flury基因进行替换和病毒拯救,得到5株重组狂犬病病毒:r HEP-sh N、r HEP-sh P、r HEP-sh M、r HEP-sh G和r HEP-sh L,通过对其感染细胞后细胞自噬水平的研究得出r HEP-sh M与GD-SH-01一样可以诱导明显的LC3-I/LC3-II转换,而r HEP-sh N、r HEP-sh P、和r HEP-sh G只能诱导较弱的细胞自噬。从而初步得出GD-SH-01的M基因在诱导细胞自噬方面起到最主要的作用。接下来,我们构建了4个质粒,它们分别可以表达结构蛋白与m RFP蛋白融合的融合蛋白。质粒转染细胞后我们发现单个蛋白在细胞中的表达并不能诱导细胞自噬,因此GD-SH-01诱导的细胞自噬是与病毒粒子的特性有关而不是单个狂犬病病毒结构蛋白可以诱导的。本论文首次揭开了狂犬病病毒与细胞自噬的关系,首次证明狂犬病病毒可以诱导细胞自噬,且初步阐明了狂犬病病毒诱导的细胞自噬和细胞凋亡之间的关系。M基因作为最主要促进GD-SH-01诱导细胞自噬的结构基因是如何发挥此功能的,与宿主细胞之间又有何互作关系需要之后进一步的研究与探讨。