论文部分内容阅读
在细菌的DNA上进行磷硫酰化修饰（硫修饰），而硫修饰DNA在电泳过程中发生降解表型（DNA degradation，Dnd）。负责这种磷硫酰化修饰功能的蛋白由5个连锁并存在于一个基因组岛上的5个基因dndA-E编码，其中四个基因dndA和dndC-E是磷硫酰化修饰所必需的基因。而对于生理学意义直到最近，才在天蓝色链霉菌中发现了特异地限制磷硫酰化DNA的基因，在沙门氏菌中发现了磷硫酰化修饰限制系统。到目前为止磷硫酰化修饰DNA电泳过程中降解机制不明，且其生理学意义知之甚少。用化学合成的模拟底物磷硫酰化修饰的二核苷dGSA和PAA-TAE激活液反应，作为研究磷硫酰化DNA电泳过程中降解机制的模拟反应，产物在HPLC图谱上显示6个新的UV254nm吸收峰。PAA-TAE激活液的化学组成包括了过氧化氢、过氧乙酸、乙酸、Tris碱和乙二胺四乙酸（EDTA）。将各个组分解离开来分析，其中PAA能够直接将去离子水中的dGSA氧化切割生成6个产物（化合物2-7），不需要Tris等一级胺的参与。在不同pH的Tris溶液中用PAA氧化切割dGSA，得到各个氧化切割产物的比例是不一样的。在1%乙酸溶液中用PAA处理dGSA，可以得到高比例的过渡态氢膦酸酯化的二核苷dGHA（化合物2），这为后续很多实验奠定了基础。通过高分辨质谱的数据分析得到各个化合物的精确分子量和可能的化学分子式，再根据各个化合物断裂后形成的离子碎片与原结构的比较，初步推测了化合物2-7的可能结构。根据推测的结构，利用化学合成的标准品与各个化合物的HPLC保留时间、紫外吸收特征、质谱、二级质谱等特性的比较，最终确定了各个氧化切割产物的具体结构。化合物2是腺嘌呤鸟嘌呤脱氧核糖核苷二核苷的氢膦酸二酯dGHA，化合物3是正常的二核苷酸dGOA，化合物4是带有鸟嘌呤脱氧核糖核苷的氢膦酸单酯，化合物5是腺嘌呤脱氧核糖核苷，化合物6是鸟嘌呤脱氧核糖核苷，化合物7是带有腺嘌呤脱氧核糖核苷的氢膦酸单酯。通过在酸性环境下制得高比例的过渡态化合物2，然后将反应液冷冻干燥，再溶解在不同pH溶液中进行HPLC-MS检测，在pH>5.0的条件下氢膦酸二核苷dGHA发生水解断裂，最终提出了磷硫酰化DNA被PAA通过先氧化再水解的两步降解机制。用磷硫酰化二乙酯作为底物和PAA或者过氧化氢反应，反应液经冷冻干燥后发现有刺激气味的黄色物质产生，用GC-MS确定了该物质是单质硫。在酸性条件下制得了高比例的氢膦酸酯化的二核苷dGHA，然后用Tris碱迅速调节pH到7.0，发现有大量的氢膦酸酯化的二核苷转化到正常的二核苷。而磷硫酰化的基因组DNA也具有类似的现象，当PAA处理后的样品迅速调pH之后DNA降解现象急剧减弱甚至消失。过氧化氢也能够和磷硫酰化DNA直接发生反应，并将磷硫酰化DNA氧化到正常状态的磷酸酯DNA或使其氧化损伤断裂。最终提出磷硫酰化DNA在电泳过程中发生的化学反应即降解机制，磷硫酰化DNA的最终命运有两种可能性，一种是磷硫酰化DNA可以在PAA等氧化剂的作用直接氧化到正常的DNA，或者先被氧化到氢膦酸酯然后再被氧化到正常的DNA而不会引起磷硫酰化DNA断裂降解；另一种是磷硫酰化DNA被PAA氧化到氢膦酸酯的DNA，然后被水解而表现为磷硫酰化DNA电泳过程中的降解。当用不同浓度的磷硫酰化二核苷dGSA与过氧化氢反应，HPLC检测反应后剩余的过氧化氢量，磷硫酰化dGSA量的增加可明显地消耗更多的过氧化氢，而正常的磷酸酯化的二核苷dGOA则不能够消耗过氧化氢，证明磷硫酰化DNA能够作为还原剂消耗过氧化氢。用不同浓度的过氧化氢或过氧乙酸与磷硫酰化DNA反应，发现在0.14mM PAA作用下就有正常的二核苷dGOA生成，而利用MS的高精度特性可以在10μM PAA存在下检测到dGOA生成。暗示生理氧化压力条件下，磷硫酰化的DNA可以作为抗氧化剂消耗过氧化氢而减小氧化压力对生物体的影响。过氧化氢处理含有和缺失磷硫酰化DNA的沙门氏菌株，生长曲线显示含有磷硫酰化修饰DNA的野生型、dptＢ缺失突变株能够在较高浓度的过氧化氢环境下生长，而缺失了磷硫酰化修饰DNA的dptＣ、Ｄ、Ｅ突变菌株则不能够在较高浓度的过氧化氢环境下生长。这就证明磷硫酰化修饰的DNA赋予了微生物抵抗一定量的过氧化氢的能力。用不同浓度的过氧化氢处理含有或缺失磷硫酰化DNA的沙门氏菌株，提取总基因组DNA电泳检测，磷硫酰化DNA的菌株在一定浓度的过氧化氢处理后其DNA保存的比较完整，但缺失磷硫酰化DNA的菌株其DNA发生了明显的双链断裂现象。表明磷硫酰化DNA在体内要比非磷硫酰化DNA更加耐受氧化压力造成的氧化损伤。用Dnd现象检测DNA磷硫酰化修饰丰度变化表明，磷硫酰化修饰丰度在一定浓度的过氧化氢处理后明显地降低。但同时在一定浓度条件下检测不到明显的变化，可能是因为活性氧分子将磷硫酰化DNA转化为正常的磷酸酯化DNA，然后在宿主dpt相关基因编码蛋白的作用下重新进行了磷硫酰化修饰。自然界的沙门氏菌含有磷硫酰化修饰DNA，能够作为抗氧化剂抵抗一定的氧化压力。当将编码沙门氏菌的整个dpt基因簇质粒转化到大肠杆菌DH10B中，赋予新宿主菌以磷硫酰化修饰DNA的特性，增加了宿主菌对抗过氧化氢的能力。证明磷硫酰化DNA可以给细菌带来抗氧化压力的能力，也可以解释为什么编码磷硫酰化修饰DNA的基因处于一个基因组岛上，使其能够在微生物间进行水平转移然后赋予新宿主以抵抗氧化压力的能力。综上所述，磷硫酰化DNA在电泳过程中降解主要是因为被过氧化物氧化生成氢膦酸酯化DNA，然后发生水解而断裂；磷硫酰化DNA能够作为抗氧化剂保护DNA免受氧化损伤，并消除一部分的氧化压力，从而提高宿主菌在氧化压力下的生存能力。