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甲肝病毒(Hepatitis A virus,HAV)和戊肝病毒(Hepatitis E virus,HEV)是两种急性病毒性肝炎病原体。HAV和HEV分属于微小核糖核酸病毒科和肝炎病毒科,均为无包膜,单正链RNA病毒。全世界每年约150万人感染HAV,但血清学证据表明每年实际新增感染病例达上千万[2]。全球戊肝病毒每年感染2千万人,导致7万人死亡,3千例死胎[3]。受戊肝病毒感染的孕妇中,约20%会死于感染导致的肝衰竭[4]。甲肝病毒和戊肝病毒均通过粪口途径传播,临床症状相似。甲肝病毒和戊肝病毒共感染的病例以及二者同时爆发已有报道[5,6]。目前,已有相应疫苗用于接种预防甲型和戊型肝炎。甲肝疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗。甲肝灭活和减毒活疫苗均表现出了良好的保护效果[7,8]。戊肝疫苗为原核表达的开放读码框2(Open Reading Frame 2,ORF2)第452-617位氨基酸区域亚单位疫苗,够提供良好的免疫保护[9]。联合疫苗具有简化免疫程序、减轻受种者精神和经济负担,降低漏种率等优势,是疫苗研究的发展方向。HAV能够在2A-2B连接区携带约600bp的外源基因片段,并能够维持稳定及感染性[10]。因此,HAV可以作为其他病原体抗原表位的表达载体发展联合疫苗。而戊肝病毒的疫苗相关中和抗原表位定位于ORF2第452-617位氨基酸区域[9,11]。进一步的构象依赖中和表位位于ORF2第459-606位氨基酸区域[12]。因此可以将甲肝病毒作为表达载体,表达戊肝病毒中和表位,有望以更低的成本开发新的重组联合疫苗。为验证上述设想,本研究以甲肝病毒18f株为载体,将编码戊肝病毒ORF2第459-606位氨基酸基因克隆入18f株基因组2A-2B区域,成功构建了重组嵌合病毒HAV-HEp148。免疫荧光显示重组病毒具有感染性,并且能够在细胞内表达HEp148蛋白;进一步的Western Blotting检测,提示重组HAV-HEp148表达的HEp148蛋白能够形成同源二聚体,模拟HEV抗原天然构象。直接电镜和免疫电镜证实HAV-HEp148具有HAV形态学特征。通过RT-PCR检测重组病毒HAV-HEp148的外源基因稳定性,证实HEp148基因在5代以内能稳定存在。以P3代病毒作为毒种,经扩增纯化后,其感染性滴度可达7.0logCCID50/ml。免疫Balb/c小鼠后,甲肝病毒特异IgG抗体几何平均滴度可达115852,而戊肝病毒特异IgG抗体几何平均滴度达9122.8。与甲肝减毒活疫苗和戊肝亚单位疫苗免疫效果比较无统计学差异。此外,HAV-HEp148诱导的抗HAV和HEV IgG无剂量依赖效应;为了研究HAV对外源基因的剪切机制,通过在HAV 2A-2B区插入不同长度外源基因进行研究,发现外源基因的稳定性与基因组二级结构的自由能密切相关,基因组自由能越接近野生型,外源基因越稳定。病毒基因组二级结构自由能有可能作为预测外源基因稳定性的参考指标。对外源基因局部二级结构的研究发现剪接位置呈两个颈环结构构成“L”型二级结构区,高度保守。外源基因的二级结构决定了剪接的位置,而自由能决定了发生剪切的概率。通过对外源基因剪切机制研究还发现,HAV对153bp以内的外源序列具有良好耐受性。携带ORF2第408-458aa的重组病毒HAV-HEp51能够维持稳定至少10代。用重组病毒HAV-HEp51免疫小鼠后,产生了 HEp51特异的血清IgG抗体,其抗体水平与HEp51合成肽免疫效果无明显差别,表明HAV能在体内呈递外源小肽,并诱导良好免疫反应。上述工作初步探讨了 HAV作为载体,发展甲戊重组联合疫苗的可能性,为进一步开发以HAV为载体的重组联合疫苗奠定了一定的研究基础。同时初步探讨了HAV影响外源基因稳定性的可能因素和其发生剪切的可能机制,为将来完善HAV载体研究做了一些初步性的工作。