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牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)不仅能够感染牛、鹿等哺乳动物,还可以通过空气和食物感染人,从而引起结核病。与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)类似,牛分枝杆菌主要感染巨噬细胞,通过多种机制适应胞内环境并进行繁殖与传播。而巨噬细胞则通过凋亡机制控制细菌的传播。除外源性的死亡受体和内源性的线粒体损伤这两条经典的凋亡途径外,内质网应激这一条新的凋亡途径也越来越受到重视。本研究着眼于巨噬细胞内质网应激引起细胞凋亡这一新的机制,不仅探究了牛分枝杆菌感染引起巨噬细胞发生的凋亡是否由内质网应激所引起,还研究了牛分枝杆菌感染引起的巨噬细胞内质网应激导致的细胞凋亡的具体信号通路和分子机制。具体研究内容和结果如下:1.本研究首先用牛分枝杆菌以MOI 10感染小鼠Raw 264.7巨噬细胞,检测了细胞的凋亡率、Caspase的表达,证实了牛分枝杆菌感染能够引起巨噬细胞发生凋亡;其次,通过观察内质网形态学变化和检测内质网应激相关因子的活化,证实了牛分枝杆菌感染能够引起巨噬细胞内质网应激。为了进一步研究该细胞凋亡是否由内质网应激引起,本试验用内质网应激特异性抑制剂4-PBA对细胞进行预处理,然后感染牛分枝杆菌。结果表明,4-PBA抑制了内质网应激相关因子和Caspase的表达,从而证实了牛分枝杆菌诱导的内质网应激是导致细胞凋亡的一个原因。另外,本试验通过使用内质网应激的激动剂Tm和抑制剂4-PBA预处理巨噬细胞,从正反两个方面验证了内质网应激引起的细胞凋亡能够有效地控制巨噬细胞内牛分枝杆菌的数量。2.为了研究牛分枝杆菌诱导的内质网应激引起的与细胞凋亡相关的具体信号通路的变化,本试验首先检测了内质网外膜蛋白STING转移到胞质与下游分子TBK1共定位的情况以及不同时间点TBK1的磷酸化变化。结果表明,牛分枝杆菌能够引起STING的转位并迅速与TBK1在胞质中组装聚集,从而激活TBK1。然后,通过4-PBA对细胞进行预处理,结果发现4-PBA抑制了STING与TBK1的共定位以及TBK1的磷酸化水平。为了研究TBK1活化对其下游分子IRF3的作用,本试验利用两种不同浓度的TBK1特异性抑制剂BX-795预处理巨噬细胞,然后感染牛分枝杆菌,在感染后24 h检测IRF3的磷酸化水平。结果发现BX-795显著抑制了 IRF3的磷酸化水平。另外,通过细胞免疫荧光检测发现牛分枝杆菌感染后24 h,磷酸化的IRF3进入到了细胞核,该结果进一步证实了牛分枝杆菌能够引起IRF3的活化。3.本研究探索了 STING-TBK1-IRF3信号通路的活化引起细胞凋亡的分子机制。首先,本试验在感染牛分枝杆菌后检测了线粒体的膜电位以及细胞色素c和Bax的转位。结果表明,牛分枝杆菌的感染使线粒体膜电位下降,并能够引起细胞色素c从线粒体转移到胞质,Bax从胞质转移到线粒体;并通过BX-795对细胞预处理,进一步证实了 IRF3的活化能够引起线粒体发生损伤。然后,本试验对IRF3和Bax进行了免疫共沉淀,结果表明活化的IRF3与Bax相互作用,共同转移到了线粒体引起线粒体损伤。最后,研究发现BX-795降低了牛分枝杆菌引起的Caspase-8和Caspase-3的活化,表明活化的IRF3最终通过Caspase-8和Caspase-3引起细胞凋亡。本试验发现BX-795的预处理显著增加了牛分枝杆菌在巨噬细胞内的存活。